实时荧光定量PCR技术
多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术发明至今已20多年了，在这期间这项技术得到了不断的发展，近年来出现的实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。
原理
real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在real-time 技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光标记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能。（2）此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展促成了real-time Q-PCR方法在研究工作中的运用。PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用终点法对PCR产物定量存在不可取之处。在real-time Q-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值（threshold）是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline），荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数（Ct）。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
在医疗领域的具体应用
（一）感染性疾病的诊断
1. 用于各种感染性疾病的早期诊断
PCR在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。从理论上来说只要样品中有一个病原体存在，PCR仪器就可以检测到。与病原体抗体检测方法比较具有早期、快速诊断等优点。定量PCR成功的解决了“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。定量PCR研究资料表明，病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性。
2. 病原体含量分析
1）疗效考评
2）指导制定感染性疾病的合理治疗方案
3）了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况
3. 病毒性疾病中病毒的耐药性变异株的测定，为疾病的治疗进行指导
4. HLA分型，取代传统电泳方法
（二）遗传病诊断
遗传性疾病根据其遗传方式分为单基因遗传病和多基因遗传病。因此，在诊断遗传性疾病时又分为等位基因检测、多基因遗传病的突变检测和基因表达异常所致遗传病检测。如：
1. 地中海贫血
基因的突变和缺失均会引起各种珠蛋白的表达不平衡，用荧光定量PCR检测各种珠蛋白基因表达差异，是地中海贫血诊断的有效手段。
2. 应用于胚胎植入前遗传疾病的诊断
（三）肿瘤检测
1. 肿瘤相关基因表达的检测
包括：癌基因、抗癌基因、肿瘤转移基因和转移抑制基因。
例如：乳腺癌与12种肿瘤基因相关，包括：mam、PTP、mamB、CEA、CK19、VEGF、erbB2、mucl、c-myc、p9、vim、Ki67
2. 肿瘤标志物的检测
如：癌胚抗原、标志性酶、同工酶、抗体、激素、细胞因子和受体的检测。端粒酶基因是今年最新发现的肿瘤的标志物。
3. 肿瘤耐药基因的检测（MDR）
在急性白血病MDRI基因表达的研究中，发现初始组的MDR表达水平为0.22±0.01，缓解组为0.25±0.07，而难治复发组0.44±0.07。
在大肠癌MDR基因组表达的研究中，发现化疗MDR的表达0.5，化疗中0.50-0.97，而高分化腺高于中、低分化腺癌。
4. 与肿瘤相关的病毒基因
例如：HBV病毒与肝癌的发病有一定的相关性，EB病毒与鼻咽癌的发病有一定的关系等。
（四）药物及医疗相关
1. 新药的开发研究
2. 超早期感染的用药和治疗研究与开发
3. 新临床诊断及检验试剂的开发
4. 个人基因型与药物疗效之间的关系
5. 药物疗效的研究
（五）与疾病相关
1. 新的预后指标的研究
2. 合理用药的研究
3. 建立病原体分子诊断标准
4. 疾病的发病监控研究
5. 研究ELISA方法的漏检率
