通用型RT-LAMP反应液试剂盒

1.产品编号：LR001
2.产品规格：25次
3.中文名：通用型RT-LAMP反应液试剂盒

4.技术背景：
环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一种新型的核酸扩增技术。反应的过程主要分为循环扩增反应起始物的形成和循环扩增反应。其基本原理是采用4/6条特异引物和具有链置换功能的DNA聚合酶，在65℃左右对核酸进行等温扩增。目前，该技术已经应用于人类及动植物细菌、真菌、寄生虫、病毒等病原体的快速检测。LAMP技术具有下面的优点：
1）在恒温的条件下实现核酸的扩增，不需要热循环仪；
2）特异性高，采用4/6条特异引物识别目的基因上的6/8个区域；
3）扩增速度快，效率高，可在30-60min内获得结果；
4）结果判定简单，无需电泳即可实现肉眼可见的扩增效果。
5.适用范围：
可用于一切与LAMP相关的快速RNA等温扩增技术。
6.组成及保存条件：

7.使用方法： 使用时，取17.6 μL RT-LAMP反应液，加入LAMP DNA 聚合酶、反转录酶、引物、模板，并加入无核酸酶H2O补足体积至25μL即可进行反应。
8.反应举例：
注意：以下举例多数情况下可供参考。实际反应条件因模板、引物等的不同而有所差异，应根据实际情况，设定最佳反应条件。

1. 制备RNA模板：可使用商业化试剂盒来提取RNA。试剂盒内的阳性对照须与标本一起处理。
2. 制备反应液：融解RT-LAMP反应液，混匀，短暂离心。在反应管中加入以下组分：

如在反应管中加入SYBR Green Ⅰ1µL，可直接在荧光定量PCR仪中进行荧光定量检测。

3.等温扩增：混匀，置于60～65℃保温30～90min，80℃ 10min灭活LAMP DNA聚合酶，产物置于-20℃备用或立即用于下游检测。

4.扩增产物的检测：向扩增管中直接加入1µL的显色剂，混匀，观察颜色的变化，阳性样品变呈浅绿色，阴性样品仍为橙色。建议在黑色背景下观察。

另外，还有以下几种常用的检测方法：

1. 琼脂糖凝胶电泳。取扩增产物5µL，1～2%的琼脂糖凝胶电泳，可见LAMP特征性电泳图谱。
2. 荧光定量PCR检测。
3. 根据反应生成的白色焦磷酸镁沉淀，直接用肉眼进行检测判断。

9.注意事项：
1）首次融解后轻轻混匀，然后适量分装，于-20℃保存，以避免多次反复冻融及造成污染。
2）引物设计对成功扩增十分关键。除用于SNP分型外，尽量以保守区设计引物。引物至少包括F3/B3和FIP/BIP，加入环状引物Floop/Bloop可以使反应速度大大提高。应优化引物序列，GC含量和尽量避免二级
结构。反应中各个引物的浓度及比例对扩增的效果有一定的影响。
3）LAMP扩增具有特异性强、灵敏度高、时间快、不需要特殊仪器设备等优点。但太高的灵敏度使得其比普通PCR扩增更加容易污染导致假阳性。因此，必须高度重视扩增产物的污染。常规措施包括严格的实验分区（试剂准备区、标本制备区、反应区、分析区）、添加UNG和dUNG（可能导致反应效率下降）、使用荧光定量等不开盖检测方法。实验室一旦遭到污染，所有相关试剂必须全部更换。
4）反应管冷却至室温后开盖加入显色剂观察结果能有效避免反应产物外逸，建议反应结束后置室温冷却。
5）严防操作环境、使用的容器耗材和试剂的RNase污染，所用器具与耗材需进行无RNase处理，操作过程中勤换手套。
6）本产品仅供科研使用。
10.保存条件：
所有试剂-20℃保存。
11.有效期：
12个月
12.技术支持信息：
如有任何问题或欲索取更多产品信息，请Email至support.smartshining@gmail.com；或拨打电话：0755-33019267。