禽流感病毒通用型及H5N1亚型超分支滚环扩增试剂盒

1.产品编号：

2.检测特点
超分支滚环扩增（hyper-branched rolling circle amplification，HRCA）方法是一种新型的核酸扩增技术，该方法是利用滚环扩增和链置换反应进行基因扩增，其具有下面的特点：
1）本检测方法可以在恒温的条件下实现核酸的扩增，不需要热循环仪；
2）本方法特异性高；
3）扩增速度快，可在30-60min内获得结果；
4）扩增效率高；
5）结果判定简单，无需电泳可以直接实现肉眼可见的扩增效果；
6）本检测方法使用酶混合物，无需额外的反转录步骤，在恒温（65℃）情况下，可以一步实现反转录和核酸的扩增。

3.检测原理
　 特定核酸序列的扩增是分子生物学的一项基本技术，随着分子生物学的发展，新的核酸技术不断涌现。滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法，是借鉴病原生物体的滚环复制而提出的。滚环扩增扩增起始于引物和模板单链的杂交，然后在具有链置换功能的DNA聚合酶的作用下延伸，形成与模板链互补且具有大量重复序列的线状单链。滚环扩增（RCA）技术凭借其高特异性、高灵敏度和易操作性而具有很大的应用价值和潜力。
超分支滚环扩增（hyper-branched rolling circle amplification，HRCA），是在线性RCA的基础上发展起来的。在线性RCA的基础上，再增加一条引物，该引物和线性RCA的产物的部分序列互补，可与线性RCA产物结合并延伸扩增。同时在DNA酶的作用下置换出下游杂交到扩增产物上其他拷贝段的引物，之后被置换下来的延伸产物又可以作为第一条引物的模板进行扩增。通过重复循环，进而得到大量的扩增产物。反应生成副产物焦磷酸镁，可通过肉眼观察是否有白色沉淀，简易判断是否为阳性。

4.适用范围
　本试剂盒可适用于各级实验室或现场的禽流感病毒病毒通用型及H5N1亚型的快速筛选检测。
适用于各级疾病控制中心对人禽流感的初步筛选检测、各出入境检验检疫局的禽流感检测、各级兽医防疫部门的禽流感检测和快速诊断、各大禽类养殖公司的现场检测等。

5.产品规格：48份/盒

6.试剂盒组分

7.质控标准
反应管离心后，肉眼观察时，阴性对照管无白色沉淀，阳性对照管有白色沉淀，否则实验失败。

8.适用仪器
常规PCR仪、恒温水浴锅、恒温保温设备。

9.所需仪器和耗材

　①所需仪器

　　常规PCR仪或恒温水浴锅；微量管离心机； 8排管离心机；振荡混匀器；移液　　器（0.5-10µl、10-100µl、100-1000µl）

　②所需耗材

　　无DNA/RNA酶的无菌离心管（0.5ml、1.5ml）；枪头（10µl、100µl、1000µl）　　；碎冰；冰盒

　③所需试剂

　　核酸抽提试剂

10.操作步骤
（1）核酸的抽提
根据常规的核酸抽提的方法或核酸抽提试剂盒的说明书抽提样品和阳性对照的核酸。
（2）试剂配制

　①从-20℃冰箱中取出试剂，在室温下溶解后即刻放于冰上；

　②根据下表于冰上配置反应液：

　③于振荡器上将总的反应液混匀，瞬时离心，取15µl于各PCR反应管；

　④向各反应管中加入10µl样品RNA模板，总反应体积为25µl；

　⑤取10µl无DNA/RNA酶水作为阴性对照的模板，取10µl阳性对照抽提的核酸作为　　阳性对照的模板进行检测；

　⑥用移液器吹打混匀，瞬时离心，尽量避免溶液中气泡产生。

（3）扩增反应

　①普通PCR仪上扩增：

　　反应条件：65℃，60min；80℃，10min。

　②水浴锅扩增：

　　用温度计将水温调至65℃，恒温扩增60min。再加热至80℃灭活酶10min。
（4）检测
　　取反应扩增管，离心，，肉眼观察管底是否有白色沉淀。
（5）判断

　　直接目测判断：

　　离心后，阳性对照管底部有白色沉淀，阴性对照管无沉淀，以上两个条件应该同　　时满足，否则，此次试验视为无效。
　　样品离心后与阳性对照和阴性对照比对，底部有白色沉淀判断为阳性，无白色沉　　淀判断为阴性。

11.注意事项
　本方法为禽流感检测的快速筛选检测方法，所有的阳性结果均为可疑阳性，需要采用确证的方法重新确证后才能出具最终阳性结果。
本方法的灵敏性比real time PCR检测方法高10倍，扩增效率极高。因此，扩增产物极易形成污染而导致假阳性结果出现。因此，在实验室尽量避免打开扩增产物的管盖。如果必须打开，请于独立的空间打开，最好于实验室外打开。
（1）试剂盒适用时的注意事项 、

　　①本试剂盒应保存于-20℃以防止酶降解；

　　②一旦取出反应液后，应立即将剩余的试剂保存于-20℃冰箱中；　

　　③反复的冻融可影响试剂盒的扩增效果，应尽量减少试剂盒反复冻融的次数；

　　④在室温溶解试剂后，应瞬时离心，将管壁和管盖中的液体离心于管底，轻微振　　　荡后再瞬时离心，并立即将试剂置于冰上进行操作。

（2）配制反应液时的注意事项
　　气泡可导致酶失活，导致假阳性结果的产生。当混匀反应液时，应尽量避免气泡　　产生。如果产生了气泡，请高速离心以去除气泡。

（3）扩增后处理

　　①扩增后的反应管应尽量避免打开管盖，否则，扩增产物形成的气溶胶不但污染　　　其他样品，而且还污染检测区域，进而造成假阳性结果。如果检测区发生了污　　　染，必须打开实验室，确保通风顺畅，3天内才能完全去除了污染。由于扩增　　　片段较小，所以检测区发生污染时，采用紫外灯照射的效果并不理想。

　　②如果需要打开管盖进行肉眼检测，请务必于实验室外打开。

（4）操作时的注意事项

1. HRCA反应非常灵敏，即便是非常微量的扩增产物污染反应液，可导致假阳性结果。因此，在处理样品和配制试剂时，应采用不同的工作台以防止污染的产生。
2. 处理样品时，务必遵守生物安全管理规定。有关实验室管理规范请参照国家有关部门颁布的基因扩增实验室管理规范执行。
3. 由于RNA可以被RNA酶降解，处理时应特别小心。RNA酶可存在于样品（血液和尿液）、气管组织、试验器具、试剂、水、操作人员的唾液和汗液中。RNA酶非常稳定，可抵抗高热，即便高压灭菌后，仍然能够保持其活性。为了避免RNA酶的污染，应遵循下面几点：

　①对RNA操作指定专区和专用的工具；

　②实验必须严格分区操作：PCR前准备区—准备实验试剂；样品处理区—检　　测样品、模板处理区；检测区—PCR扩增检测；

　③请使用无RNA/DNA酶的一次性试管和枪头；

　④请使用无RNA酶的水；

　⑤操作人员请戴手套和口罩，以防止唾液和汗腺中的RNA酶污染样品。

（5）本试剂盒仅用于体外检测等研究用途，使用前请仔细阅读本说明书全文。
（6）如果操作人员无核酸检测领域的相关知识和经验，可能会导致错误判断。请确　　 保本试剂盒是在有经验的技术专家监督下使用。
（7）如果错误的结果与试剂盒无关，本公司不承担任何的责任。
（8）请在有效期内使用本试剂盒。

12.贮藏
试剂盒应在-20℃保存，避免反复冻融。

13.有效期
有效期12个月。

14.生产企业
公司名称：深圳博睿祥晖生物技术有限公司
公司地址：深圳市南山区桃源街道丽山路深圳硅谷大学城创业园504
邮政编码：518055
电话：86-755-33019267
传真：86-755-33019511
网址：http://www.smartshining.com