禽流感病毒H5亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒

　　禽流感病毒属于正黏病毒科A型病毒属。H5N1属于流感病毒的一种亚型，它是一种人畜共患的高致病性禽流感病毒，其中H5蛋白是判断高致病禽流感的一种可靠的标志物。禽流感疫情给我国的养禽业造成重大损失，不仅危害养鸡业，而且对部分地区养鸭场和养鹅场也造成重创，由于H5N型禽流感病毒可以由动物传染给人，从而威胁到人类的生命安全。 当禽类感染了H5N1高致病禽流感，致死率可达100%，而对人类来说致死率可达50%以上（根据已经确诊的270位病人）。
　　高致病性禽流感的发生往往是突如其来的，而且发生后会迅速蔓延，目前还没有很有效的治愈禽流感的方法，所以对于禽流感的早诊断就显得至关重要。由于常规的诊断方法耗时、费力、诊断周期长、不适应禽肉产品的快速检测，所以迫切需要建立一种快速、敏感、特异的诊断方法，缩短检测周期，加快检测速度。为了适应活禽、禽肉制品中快速检测的需要，根据我国禽肉检验检疫的特点，结合荧光RT-PCR的敏感、快速、特异之优点，我们公司根据H5特异保守的序列自行设计检测的引物及探针 ，开发了H5亚型禽流感荧光RT-PCR检测的试剂盒，
　　此试剂盒具有快速、灵敏度高、特异性好、应用范围广、操作简单等优点。

1.产品编号：
本试剂盒适用范围：咽拭子、泄殖腔拭子、冷冻禽肉组织渗出液、鸡胚尿囊液等样本中禽流感亚型H5的特异检测。

2.试剂盒组成：

注意：请自备75%酒精，氯仿以及异丙醇（-20℃预冷）

3.储存条件及有效期：
本试剂盒保存于-20℃，保质期为6个月.

4.适用的仪器：
ABI系列、MJ系列、Bio-Rad，Roche系列等荧光定量PCR仪。

5.样本处理：
咽拭子、泄殖腔拭子：向装有拭子的离心管中加入500ul的 PBS或生理盐水，剧烈震荡30秒。将尽量挤出的液体转移到另外的离心管，然后5000rpm离心30秒，取上清备用。
组织渗出液、尿囊液：5000rpm离心1分钟，取上清备用。

6.检测流程：

1. 样本处理（在样本处理区操作）-- 提取RNA

　①取200ul经前处理的样本，加入600ul RNA提取液混匀，再加入200ul氯仿，震荡　　混匀。静置5min，12,000rpm离心10min。
　②将上清转移至另一离心管，加入200ul异丙醇（-20℃预冷）颠倒混匀。静置　　5min，12,000rpm离心10min。
　③去上清，向沉淀中加入600ul75%酒精 ，颠倒洗涤。12,000rpm离心5min，去上清　　，室温干燥沉淀。
　④加入15ul DEPC水，轻弹数下，-20℃保存备用。

　2.　PCR试剂准备（在PCR试剂准备区操作）

　　取出试剂盒中的PCR混合液，室温融化并颠倒混匀，3000rpm离心5sec。Taq酶，反转录酶使用之前3000rpm离心5sec。PCR反应管数为为n（n=1阳性对照+1阴性对照+样本数）。每个检测反应体系如下表：

将混合体系混匀后分装15ul至各个反应管，然后将其转移至样本处理区。

　3.　加样（在样本处理区操作）

　　分别取10ul样本提取物及阴、阳性对照加入相应的反应管中，盖紧管盖，转移至检测区置于PCR仪上。

　4.　荧光定量PCR（在检测区操作）：
　　　荧光定量PCR反应条件（25ul体系）：第一步：50℃ 30min，95℃  5min，　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1个循环；第二步：95℃  15sec ，　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　60℃ 1 min（收集荧光信号），40个循　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　环
※　Roche系列的荧光定量PCR仪变性温度为93℃，其它条件不变。

7.结果分析条件设定：
基线及阈值的设定：取3-10或3-15个循环的荧光信号确定为基线；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品及阴性样本的扩增曲线的最高点，不出现Ct值并与阳性对照的指数期相交为准。
请详细参阅荧光定量PCR仪的使用手册或与我公司的技术服务人员联系。

8.结果判断：

　①本试剂盒的灵敏度：102-103copies/ml

　②阴性对照的Ct值不显示或为40；阳性对照的Ct值应小于30.否则结果无效。

　③检测样本Ct值小于或等于30且曲线有明显的扩增期，结果测定有效，可直接判　　断样本为阳性。

　④检测样本Ct值大于30且小于40，需重复一次，若此时Ct值仍小于40，且曲线有　　明显的扩增期，可判断样本为阳性，否则为阴性。

9.注意事项:
　①本试剂盒仅用于体外检测。

　②实验必须严格分区操作：a区：PCR前准备区—准备扩增所需实验试剂；b区：　　样本处理区—待测样本、模板处理；c区：检测区—PCR扩增检测。各区物品均　　为专用，避免污染。

　③所用的离心管和枪头都需经DEPC水处理，75%乙醇也要用DEPC处理过的水配　　制，以灭活RNA酶。检测过程中需戴口罩及手套，同时要避免各区之间所戴手套　　造成的交叉污染。

　④禽流感H5亚型PCR混合液融化后颠倒数次混匀并作短暂离心，其它试剂充分融　　化后请短暂离心。反应液分装时应尽量避免产生气泡。

　⑤上机前注意检查各反应管是否盖紧，以防污染仪器及降低试验误差。

　⑥工作台及各物品定期用1%次氯酸钠，75%酒精或紫外灯进行消毒。实验过程中　　的枪头及其它废弃物一同灭菌后丢弃。

10.生产企业
公司名称：深圳博睿祥晖生物技术有限公司
公司地址：深圳市南山区桃源街道丽山路深圳硅谷大学城创业园504
邮政编码：518055
电话：86-755-33019267
传真：86-755-33019511
网址：http://www.smartshining.com