产品名称:PUCm-T载体 V2000/2001
CAT# |
SIZE |
PRICE（￥） |
V2000 |
20 |
240 |
V2001 |
100 |
900 |
I. 简介
博彩生物科技公司有限公司生产的pUCm-T是一种新颖的T载体，专为简化PCR产物的克隆而设计。pUCm-T有如下显著特点：适用范围广，可用于Taq、Tth DNA聚合酶及其变体扩增的PCR产物的克隆，通常也适用于Taq Plus和SuperTaq等由Taq和Pfu混合聚合酶体系扩增的PCR产物（PCR产物在3‘末端后要带有一个突出的碱基A）；pUCm-T多克隆位点和b-半乳糖苷酶阅读框架的调整大大方便了克隆的蓝/白筛选；插入片段可以用Pst I单酶切,也可以用EcoR I和Hind III 双酶切进行检测；插入的PCR产物可以用M13通用引物和T7启动子引物进行测序；有T7 RNA聚合酶的启动子，可以对插入片段进行体外转录。
A. pUCm-T载体图谱
B． pUCm-T载体启动子和多克隆位点序列
II. PCR产物的准备：
Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合酶扩增的PCR产物末端都带有一个突出的3’-A。Taq酶和Pfu、Pwo、Tli或Deepvent 等具有3’-5‘外切酶活性的DNA聚合酶混合扩增的产物末端可能带有3’-A。具有3’-A末端的PCR产物可以直接用pUCm-T进行克隆连接。Pfu, Pwo, DeepVent聚合酶扩增的PCR产物是平末端，要对这种平末端PCR产物进行克隆，应首先进行3’末端进行加-A的工作。有两种方法可对PCR产物进行3’末端加-A。
A．这种方法需要的时间较长，但T/A克隆成功的比率很高。
1. 设置一个50ul的反应体系。
胶回收的平末端PCR产物
5ul 10X Taq DNA Polymerase Buffer
lul 4X dNTP或dATP至终浓度为200nM
0.5ul 2.5U Taq DNA Polymerase
加水至终反应体积为50ul
2. 72ºC保温10分钟。
3. 纯化PCR片段(可用BBST生产的PCR产物纯化试剂盒)。
4. T/A连接
B．这一方法速度快，但是成功的比率不如上面的方法高。
PCR反应（50ul反应体系）结束以后，加入1ul 20mM dATP和2.5U的Taq酶，72ºC保温10分钟，然后回收PCR产物进行T/A连接。
III．连接反应
PCR产物可以通过agarose 凝胶电泳分离。BBST生产的Golden Beads 和3S 柱PCR产物胶回收试剂盒对120bp以上的DNA片段能很好的进行回收。对于一个标准的10ul连接反应体系中，一般按下列次序加入
1ul Ligation Buffer (10X)
50ng (1.5ml) 的pUCm-T
6.5ul 纯化的PCR产物(0.2pmol的PCR产物, 通常状况没有必要对PCR产物进行定量)
1ul T4 DNA Ligase
16℃下连接2小时至过夜。
IV. 转化
1.新鲜制备的或-70℃下保存的100ul感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻地将细胞均匀悬浮。
2.加入2ul连接液，轻轻混匀。
3.冰上放置30分钟。
4.42℃水浴热激60秒。
5.冰上放置2分钟。
6.加400ul SOC培养基，37℃ 200-250rpm振荡培养1小时。
7.室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400 ul上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。
8.将细菌涂布在90mm平板中，平板在使用前预先用20ul 100mM IPTG和100ul 20mg/ml X-gal 涂布。
注：细菌的用量依连接的效率及感受态细胞的感受率而进行适当的调整。
9. 平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。
V．筛选—蓝/白斑筛选
当外源DNA片段插入到pUCm-T中后，由于外源DNA的核酸序列存在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物b-半乳糖苷酶a片段的活性，因此重组克隆在X-gal/IPTG平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色。验证白斑中含有目的PCR片段时需要抽提质粒，用Pst I单酶切或用其它合适的酶切, 通过Agarose电泳初步判定pUCm-T中插入片段的大小，然后用M13通用引物或其它合适的引物直接进行测序，确定pUCm-T中插入的PCR产物是否是希望得到的目的基因。
VI. 附录
A.质量控制：
pUCm-T载体1.5ul（约50ng）+1000bpTaq酶扩增的PCR产物 6.5ul(50ng)+1ul ligation Buffer+1ul T4 DNA Ligase 16 °C条件下连接过夜。取２ul连接液转化DH5a进行蓝/白筛选，酶切鉴定插入片段的存在。40%以上的是白色克隆(效率与插入片段与载体的比例有关,模板准备不好,所有克隆将为蓝色)，90%以上的白色克隆含有目的PCR片段。
B. Restriction enzymes that cut the pUCm-T vector between one and ten times or do not cut the vector assayed using DNASTAR sequence analysis software. |
Enzyme Freq.: Position(s)
Ban I 4 : 235 408 637 1734
Bce83 I 4 : 984 1282 1523 2391
BsaJ I 4 : 354 456 632 1053
BspLU11 II 4 : 481 487 509 515
Cfr14 I 4 : 387 462 731 2173
Eae I 4 : 388 463 732 2174
Eco50 I 4 : 234 407 636 1733
Hga I 4 : 97 1004 1582 2312
Hin4 I 4 : 435 485 1780 1854
Tat I 4 : 166 172 2263 2269
Tsp45 I 4 : 56 367 2042 2253
Uba1442 I 4 : 353 455 631 1052
Asp1 I 5 : 46 81 1271 1967 2318
Bfa I 5 : 483 511 1388 1641 1976
Bka1125 I 5 : 176 401 1206 2367 2452
BsaG I 5 : 176 401 1206 2367 2452
BsiHKA I 5 : 181 406 1211 2372 2457
Bsp1286 I 5 : 181 406 1211 2372 2457
BstF5 I 5 : 83 327 1765 1946 2233
BstZ11 I 5 : 118 128 288 684 746
Eco1831 I 5 : 46 81 1271 1967 2318
EcoP I 5 : 473 484 1572 1707 1853
Fau I 5 : 107 117 277 693 735
Fok I 5 : 90 334 1752 1933 2220
Gdi II 5 : 392 467 468 736 2179
HinGU II 5 : 76 320 1765 1946 2233
Mae II 5 : 374 1596 2012 2385 2705
Mja I 5 : 482 510 1387 1640 1975
Nci I 5 : 48 83 1273 1969 2320
Sts I 5 : 91 335 1751 1932 2219
Tai I 5 : 373 1595 2011 2384 2704
Ttm I 5 : 373 1595 2011 2384 2704
Acc38 I 6 : 353 476 631 919 1040 1053
AhaB1 I 6 : 285 1827 1906 1923 2145 2761
Bco163 I 6 : 426 469 521 1157 1348 2026
Bfm I 6 : 427 470 522 1158 1349 2027
Bsa0 I 6 : 279 466 809 1233 2156 2305
BscG I 6 : 96 1218 1563 1785 1808 2330
BsmE I 6 : 420 506 513 792 1263 1780
Bst295 I 6 : 170 1167 1576 1742 2282 2708
BstO I 6 : 355 478 633 921 1042 1055
Dde I 6 : 171 1168 1577 1743 2283 2709
EcoR II 6 : 353 476 631 919 1040 1053
Fmu I 6 : 286 1828 1907 1924 2146 2762
Mly I 6 : 430 501 508 802 1258 1790
MspA1 I 6 : 114 308 717 1235 1480 2421
Ple I 6 : 415 515 522 787 1272 1775
Sau96 I 6 : 286 1828 1907 1924 2146 2762
Sfc I 6 : 427 470 522 1158 1349 2027
StyLT I 6 : 34 156 1005 1325 1351 1419
Taq I 6 : 400 445 505 517 993 2437
Tfl I 6 : 399 444 504 516 992 2436
Uba1303 I 6 : 275 462 805 1229 2152 2301
BsL I 7 : 53 461 741 915 933 1099 1378
CjeP I 7 : 435 1380 1445 1558 1678 2150 2717
CjeP I' 7 : 468 1412 1413 1591 1711 2183 2684
Hph I 7 : 24 33 1629 1856 2272 2478 2513
Mbo II 7 : 283 764 1555 1626 2381 2459 2568
Ncu I 7 : 290 771 1542 1633 2388 2466 2575
NgoB I 7 : 11 20 1636 1863 2259 2485 2500
Tsp509 I 7 : 396 573 590 665 1653 1959 2214
Ait II 8 : 491 497 1533 1544 1630 1642 2410 2427
BscA I 8 : 71 161 201 237 989 2041 2236 2481
BsmN I 8 : 77 152 207 228 980 2032 2242 2472
Cje I 8 : 201 286 939 1380 1458 1494 1558 2717
Cje I' 8 : 168 319 906 1413 1461 1491 1591 2684
CviC I 8 : 420 506 513 727 792 867 1263 1780
Hinf I 8 : 421 507 514 728 793 868 1264 1781
SfaN I 8 : 68 162 198 238 990 2042 2233 2482
Xho II 8 : 492 498 1534 1545 1631 1643 2411 2428
Tsp4C I 9 : 20 55 263 412 856 927 1397 1710 2225
Alw I 10 : 493 506 1454 1540 1542 1638 1639 2102 2419 2423
Bcef I 10 : 1 3 106 738 740 938 1519 1849 2342 2674
BsrW I 10 : 497 498 1459 1533 1545 1630 1643 2107 2410 2428
BstU I 10 : 3 5 108 740 742 940 1521 1851 2344 2676
Sel I 10 : 1 3 106 738 740 938 1519 1849 2342 2674
TspR I 10 : 398 686 795 1301 1314 1585 1734 1839 2186 2213 |
Enzyme Freq.: Position(s)
Ssp I 1 : 2590
Sty I 1 : 456
StySJ 1 : 158
StySP I 1 : 2443
Syn II 1 : 2380
Tth111 I 1 : 478
Tth111 II 1 : 1490
Uba1326 I 1 : 2760
Xcm I 1 : 484
Xho I 1 : 504
Xmn I 1 : 2385
Aca III 2 : 255 2005
Ain I 2 : 469 521
Asp697 I 2 : 1923 2145
Ava II 2 : 1924 2146
BceF I 2 : 403 1395
Bco35 I 2 : 487 1870
Bct I 2 : 386 1378
Bgl I 2 : 251 1906
Bma I 2 : 275 2152
Bpm I 2 : 509 1856
Bsp21 I 2 : 1865 1871
Bsp6 II 2 : 1419 2467
BsrD I 2 : 1847 2021
BstZ2 I 2 : 1780 1791
Drd I 2 : 97 1001
Eco57 I 2 : 1441 2453
EcoRD2 2 : 1212 1225
Fsp I 2 : 258 2008
Gsp I 2 : 305 714
HgiE II 2 : 180 1473
Hine I 2 : 245 402
Mme I 2 : 1108 1292
Nde I 2 : 184 439
Psp1406 I 2 : 2012 2385
Pst I 2 : 474 526
Pvu I 2 : 279. 2156
Pvu II 2 : 308 717
Taq II' 2 : 2472 2489
Tfi I 2 : 728 868
Uth506 I 2 : 244 1899
VpaK11A I 2 : 1923 2145
Xba I 2 : (482) 510
Aaq I 3 : 176 1206 2452
Ace III 3 : 54 845 2085
Alw26 I 3 : 45 1847 2623
ApaL I 3 : 177 1207 2453
Asp16H I 3 : 167 408 2264
Bcc I 3 : 1821 1945 2232
Bme142 I 3 : 237 769 1139
BsaW I 3 : 1099 1246 2077
BsmH I 3 : 234 766 1136
Bsp24 I 3 : 1418 1596 2690
Bsp24 I' 3 : 1386 1564 2722
BspH I 3 : 1613 2621 2726
BsrB I 3 : 585 826 2627
BsrE I 3 : 289 770 2574
BssS I 3 : 1066 2450 2757
Bst1473 I 3 : 1098 1245 2076
Csp6 I 3 : 168 409 2265
Dra I 3 : 1652 1671 2363
Ear I 3 : 296 777 2581
Eci I 3 : 964 1110 1938
EcoP15 I 3 : 1331 1389 1540
Hae I 3 : 908 919 1371
Hae II 3 : 239 771 1141
Hin8 I 3 : 234 2321 2703
Hsp92 I 3 : 236 2323 2705
Lsp1270 I 3 : 36 527 892
Msl I 3 : 2038 2197 2556
Nsp I 3 : 41 532 897
Rhc I 3 : 1612 2620 2725
Rsa I 3 : 169 410 2266
Sim I 3 : 1090 1571 1859
StyLT III 3 : 174 773 2284
Taq II 3 : 795 2134 2319
Vsp I 3 : 664 723 1958 |
Enzyme Freq.:Position
Aac I 1 : 497
Aat II 1 : 2708
Acc I 1 : 517
Acc65 I 1 : 408
Acr I 1 : 503
Acs1371 I 1 : 515
Afl III 1 : 893
Afl IV 1 : 2263
AhyA I 1 : 503
AlwN I 1 : 1309
ApaB I 1 : 186
Apo I 1 : 396
Apu16 I 1 : 443
Asp52 I 1 : 533
Asp5H I 1 : 527
Ate I 1 : 455
Ava I 1 : 504
BamH I 1 : 498
Ban II 1 : 406
Bbe I 1 : 239
BbeA I 1 : 234
Bbr I 1 : 534
Bcg I 1 : 2291
Bcg I' 1 : 2325
Bco63 I 1 : 492
Bgl II 1 : 492
Bli49 I 1 : 1852
Bsa I 1 : 1847
Bsa XI 1 : 756
BsaB I 1 : 497
Bsb I 1 : 117
BshL I 1 : 449
BsoD I 1 : 462
Bsp117 I 1 : 401
BspJ106 I 1 : 407
BspLU11 I 1 : 893
BspM I 1 : 529
Bst224 I 1 : 455
Cfr10 I 1 : 1866
Chu II 1 : 515
Cla I 1 : 445
Dsa I 1 : 456
Dsa VI 1 : 515
Ecl137 I 1 : 401
EclHK I 1 : 1786
Eco52 I 1 : 463
Eco82 I 1 : 395
EcoDR2 1 : 397
EcoICR I 1 : 404
EcoK I 1 : 2443
EcoO109 I 1 : 2762
EcoR I 1 : 396
EcoR V 1 : 452
Ecoprr I 1 : 541
Ehe I 1 : 237
Esp16 I 1 : 50
Esp3 I 1 : 45
Fsu I 1 : 474
Hinc II 1 : 518
Hind III 1 : 534
Kas I 1 : 235
Kpn I 1 : 412
Nar I 1 : 236
Nco I 1 : 456
Nli387/7 I 1 : 508
Not I 1 : 463
Pfl1108 I 1 : 1801
Ppu1253 I 1 : 2703
Pss I 1 : 2765
Sac I 1 : 406
Sal I 1 : 516
Sap I 1 : 777
Sca I 1 : 2266
Sci I 1 : 506
SexA I 1 : 476
Sph I 1 : 532
Sse8387 I 1 : 526 |
B. pUCm-T载体的酶切位点
Non-cutting enzymes :
Aca I Acc III Ace II Afa24R I Age I Ama I Aos III Apa I Ape I Asc I Asp78 I AtuC I Ava III Avr II Bae I Bal I Bbf7411 I Bbs I Bcl I Bco102 II BfrB I Blp I Bmg I Bpl I Bpu10 I Bpu1268 I BsaA I BsaF I BsaK I BsaM I BscE I BscJ I Bse59 I BseR I Bsg I BsiW I BsmF I BsmG I Bsp120 I Bsp87 I BspG I BspLU11 III BsrG I BssH II Bst1107 I Bst29 I Bst98 I BstE II BstX I Bsu36 I CfrA I Csp I Csp45 I Dra III Drd II EciA I EciE I Eco47 III Eco72 I EcoA I EcoB I EcoD I EcoD XXI EcoDR3 EcoE I EcoN I EcoR124 I EcoR124 II EcoRD3 Fin I Fse I Hpa I Mlu I Mlu1106 I Mlu113 I Msp20 I Mun I Nae I NgoM I Nhe I Nru I Nsi I Pac I Pau I Pfu I Pme I Ppu10 I Ppu6 I PpuM I PshA I RleA I Sac II SanD I Sfi I Sgf I SgrA I Sma I Sna I SnaB I Spe I Srf I Sse8647 I Stu I StySQ Swa I Uba1220 I Uba1221 I Uba1382 I UbaD I Van91 I Xma I |
位来访者