Pfu DNA Polymerase High Quality Products from SNBC

简介：

• Pfu DNA 聚合酶是从高温嗜热菌Pyrococcus furiosis 分离出的高保真（High Fidelity）耐高温DNA 聚合酶。Pfu能纠正DNA扩增（PCR）过程中产生的错误，而传统的Taq DNA Polymerase, Tth DNA Polymerase 及它们的变体如AmpliTaq, KlenTaq等都不能。高温DNA聚合酶Vent, DeepVent, Tli, Pwo, Pfu, UlTma等具有校正功能（Proof reading），但是Pfu是目前已发现的所有高温DNA聚合酶中在扩增DNA时出错率（error rate）最低的。它比Taq DNA Polymerase及变体低10倍，比Vent 和Pwo低2-4倍，比UlTma低30倍。Pfu的超常纠错特性是由该酶本身的性质决定的。其它高温DNA聚合酶与Pfu混合使用，可以部分降低产品的错误率，但是效果达不到单独使用Pfu的高保真率。在基因克隆和表达，基因突变分析等现代分子生物操作中，由于对DNA扩增产物的正确率要求特高，常常希望万无一失，所以Pfu是公认取代Taq DNA 聚合酶的首选高保真高温DNA聚合酶。

浓度：

• 2.5 -5 u / ul

活性定义：

• 1单位Pfu定义为在72C 30分钟内将10nmol 同位素标记的4X dNTP掺入到DE81纸不溶物质中所需Pfu的量。

10 X PCR 反应缓冲液：

• 100 mM KCl,160 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4,200 mM Tris-HCl, pH8.8, 1% Triton X-100,1 mg/ml BSA

质量控制：

• 经过检测无外源核酸酶活性；SDS-PAGE检测纯度大于95%；PCR方法检测无外源DNA; 能从100ng lambda 模板中扩增出1kb 和2kb 的单拷贝基因。

储存条件：

• Pfu 成品保存于50 mM Tris-HCl, pH8.2, 0.1 mM EDTA, 0.1% Tween 20, 0.1% NP-40, 1 mM DTT and 50% glycerol，-20°C,一年以上。

主要应用领域：

• 常规PCR
• 基因的高保真扩增，克隆和表达
• 基因的定点突变
• 细胞内基因突变分析

主要技术参数：

• Pfu DNA 聚合酶来源于高温嗜热菌Pyrococcus furiosis。分子量为90KD；PCR产物为平端，无3’端的单个dA； 有3’-5’外切核酸酶活性（高保真）；无5’-3’ 外切核酸酶活性； DNA聚合时的延伸速度为每分钟600碱基；最佳温度65-75度；dNTP的工作浓度为100-300mM, 最佳Mg浓度为 2-3 mM, 最佳pH为8.1-9.1；供应浓度为2.5-5U/ml；-20度保存至少一年。
• Pfu DNA 聚合酶的使用方法：

Pfu DNA 聚合酶的使用方法基本同Taq DNA 聚合酶。DNA扩增（PCR）时，50ml标准反应体系需2.5U 左右.
注意事项：

• Pfu扩增效率通常比Taq酶差，这是由于Pfu具有3’-5’的外切酶活性（高保真性）所引起的，不是由于Pfu酶的质量不稳定所致。Pfu扩增1.5kb以下的DNA片段和Taq没有多大差别。
• 10×Pfu PCR Buffer中已含有Mg2+，用该缓冲能保证扩增产物的保真性。提高反应体系的pH和Mg2+浓度能部分提高DNA扩增的产率，但产物的保真性将有所下降。不提倡用Taq PCR反应缓冲代替Pfu缓冲做高保真扩增。
• 用Pfu扩增时，引物的纯度要求较高，长度要求大于18 base, Tm在55-80℃之间。引物的浓度在0.1-0.5mM之间，比Taq略高。Pfu具有3’-5’的外切酶活性可能会降解引物，特别是溶液中没有dNTP的情况下。所以，Pfu必须是最后加入到反应体系中，并立即进行PCR反应。
• Pfu的热稳定性比Taq酶高，对于GC含量很高的模板，变性温度可以提高到98℃,而不会影响Pfu的活性。
• PCR产物为平端，不能直接用T/A克隆方式克隆。可选用Cat#K291,K301,K121,V2000等相关产品克隆Pfu扩增的PCR产物。