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核酸Dig检测试剂盒 K805

Dig Nucleic Acid Detection Kit

产品编号：K805, for 10 blots of 10x10 cm2 membrane
特别说明：实验前请仔细阅读，部分试剂用户需要自行准备。
试剂盒组成:

Contents	Vol	Storage Condition
Anti- Dig Monoclonal Antibody 1:500 dilution for Northern/Southern blot 1:50 Dilution for In situ	100ul	-20度
Anti-Mouse IgG-AP conjugated 1:500 Dilution	125ul	-20度
NBT/BCIP Stock Solution, 避光保存 18.75mg/ml NBT, 9.4mg/ml in BCIP in 67% DMSO	1ml	-20度
AP Buffer 10X (1M Tris-HCl, 1M NaCl, pH9.5)	50ml	RT
Blocking Solution 1% of Blocking Reagent , Autoclaved	250ml	RT
*Washing Buffer 10X （需要自行配制）** 1M Maleic Acid, 1.5M NaCl, pH7.5, 3% Tween 20	250ml	RT
Dig Easy Hyb Solution	100ml	-20度, 用前68度融化
DNA Dilution Buffer 50ug/ml salmon sperm DNA in TE, pH8	500ul	-20度
RNA Dilution Buffer 20XSSC: Formaldehyde: DEPC treated water=3:2:5	1 ml	-20度

Washing Buffer 10X *：本试剂盒提供配制Washing Buffer 10X 所需要的主要试剂Mlaleic Acid 和Tween 20，用NaOH调pH到7.5。用前稀释到1X.。

用途: Northern, Southern Blot，In situ 等分析，本试剂盒提供的方法为核酸转移分析。
自行需要准备的材料：20X SSC, SDS，杂交袋，常规实验室耗材和设备等
使用方法:
1.制备符合实验要求的转移膜，将膜转移到合适的杂交袋中。
2.制备符合要求的Dig标记的RNA或DNA探针。
3.如果探针为DNA，选用DNA Dilution Buffer溶解或稀释; 如果探针为RNA，选用RNA Dilution Buffer溶解或稀释; 浓度在50-100ng/ml, 探针95度处理5分钟，迅速冰里冷却，备用。
4.预杂交：68度预热Dig Easy Hyb Solution, 按每平方厘米0.1ml的比例，加入杂交液（Dig Easy Hyb Solution）, 杂交温度为68度，时间为30分钟。注意尽可能将多余的不含样品的膜去除。
5.将变性的探针转移到68度预热的杂交液中（3.5ml/100cm2），充分混匀。
6.弃去杂交袋中杂交液，将含探针的杂交液（步骤5）转移到杂交袋内，充分混匀，68度杂交过夜。
7.收集含探针的杂交液，转移过程中防止膜干燥。DNA探针可以重复使用几次， RNA探针，不建议重复使用。
8. 用2x SSC, 0.1%SDS 室温洗两次，每次5分钟。洗膜过程，可以将膜从杂交袋中取出，放在培养皿中洗。（步骤8向后都可以在培养皿中进行，但是培养皿尽可能小，便于抗体的保温处理）。
9.用0.1x SSC, 0.1%SDS 68度洗两次，每次15分钟。
10.本试剂盒提供配制Washing Buffer 10X 所需要的主要试剂Mlaleic Acid 和Tween 20，用NaOH调pH到7.5。用前稀释到Washing Buffer 1X.。用无菌稀释10X Wash Buffer。每次共计需要250ml左右。
11杂交膜从步骤9取出后，用小量1X Washing Buffer洗一次，弃去Washing Buffer，加入25ml Blocking Solution, 室温保温30分钟。
12.按膜每平方厘米0.1ml的比例稀释抗体。取10ul Anti- Dig Monoclonal Antibody抗体，用10ml Blocking Solution稀释抗体。
13.弃去步骤11中的Washing Buffer，将步骤12中的抗体转移到膜上，保温60分钟。

14.弃去抗体；（抗体可以回收重复使用几次）；用25ml 1X Washing Buffer洗两次，每次15分钟。
15.按膜每平方厘米0.1ml的比例稀释二抗。取20ul Anti-Mouse IgG-AP conjugated抗体，用10ml Blocking Solution稀释抗体。
16.弃去Wash Buffer，将稀释二抗（步骤15）抗体转移到膜上，保温60分钟。
17.弃去抗体；（抗体可以回收重复使用几次）；用25ml 1X Washing Buffer洗两次，每次15分钟。
18.弃去Washing Solution, 加入AP Buffer 20ml, 平衡5分钟。
19.弃去AP Buffer, 加入新的AP Buffer 10ml,加入200ul NBT/BCIP Stock Solution (预先将NBT/BCIP Stock 37度保温混匀溶解)，室温保温，显色过程中不要振荡。注意观察，出现条带的时间与检测基因的拷贝数、探针标记的效率有关。显色时间短几分钟，长则10多小时，需要耐心。

20.目标条带出现后，可以用水或TE洗膜终止显色。杂交结果拍照分析和长期保存。