体外转录试剂盒 K481/491/501
RNA Transcription Kit
CAT# |
SIZE |
PRICE（￥） |
K481-T3 |
10 rexs |
600 |
K491-T7 |
10 rexs |
600 |
K501-SP6 |
10 rexs |
600 |
注意: 该试剂盒不适宜用于RNA探针的制备
K481 10 reactions w /T3 RNA polymerase
K491 10 reactions w/ T7 RNA polymerase
K501 10 reactions w/ SP6 RNA polymerase
剂盒组成：
Components for 10 reactions |
Quality |
||
SK481 |
SK491 |
SK501 |
|
T3 RNA Polymersae |
100 U
0.2ml |
100 U 0.2 ml |
100U |
简介：该试剂盒主要用于体外转录合成RNA, 用于小量RNA的制备。转录的模板必须克隆在T7, T3或SP6 promoter之后。
注意事项：
1）整个实验必须戴手套操作，防止RNase的污染。
2）除Tris缓冲外，所有缓冲必须用DEPC处理。所有的管子，枪头必须高温灭菌。Tris缓冲液用DEPC-H2O配置，高温蒸气灭菌。DEPC-H2O的制备：高纯度的水中加入DEPC,终浓度为0.1%,37ºC保温8小时，然后高温蒸气灭菌，如仍有DEPC气味，将溶液置于90ºC水浴保温1小时。
3）用于转录的质粒模板必须是无RNase污染。
模板的制备：
1）用合适的试剂盒制备模板质粒。
2）模板的线性化。用合适的限制性内切酶在Promoter和插入片段的下游将质粒切开。
3）Proteinase K用100ml水解。在酶切反应体系中加入Proteinase K和2倍体积的Digestion Buffer, 使Proteinase K的终浓度为50mg/ml, 37ºC保温30分钟。
4）用等体积的苯酚-氯仿（1:1, v/v）抽提两次，每次吸取上层水溶液。
5）加入0.1倍总体积的用2.5倍体积的无水乙醇，-20C放置20分钟或更长的时间，离心收集DNA, 沉淀用70%乙醇（用DEPC-H2O配置）洗一次。
6）DNA用10 mMTris-HCl (pH7.4)/0.1 mM EDTA (该TE用用DEPC-H2O配置) 溶解，浓度为1mg/ml左右。DNA的定量：用合适的Agarose电泳，与DNA标准比较估计出DNA的浓度。
转录反应：
1） 按以下次序在冰上加入各试剂：
4 ml 5´ Transcription Buffer
2 mg 限制性内切酶和Proteinase K处理过的 DNA 模板
2 ml 10 mM rNTPmix
2 ml 100 mM DTT
40U Ribonuclease Inhibitor
5-10 ml 400-800Ci/mmol 10mCi/ml [a-32P] rUTP
(注意：如仅仅用于合成RNA, 无须加入同位素)
0.8 ml T3(K481)或 SP6 (K501)或T7 RNA Polymerase (K491)
x ml DEPC-H2O (使反应总体积为40ml )
2） 混匀，37ºC保温60分钟。
3） 加入2ml DNase I (RNase free)(10 U), 37ºC保温10分钟。
4） 产物可以不经过分离立即使用，或-70ºC保存备用。如要除去反应体系中的rNTP和其它蛋白质，可以用BBST K581 RNA Clean-up Kit 纯化，也可以1-ml Sephadex G-50柱纯化，但要求柱子无RNase污染。
注意：
1）不建议该试剂盒制备的RNA的探针。如果需要制备RNA探针，请和BBST联系。
3）非同位素转录。在我们提供的方法中加入了同位素，能制备出特异的同位素RNA探针。如果转录的目的是为了制备用于体外翻译，细胞微注射，可以用1 µl 10 mM rUTP代替[a-32P]rUTP。
4） 如果转录DNA模板对下游实验有影响的话，可以反应后加入RNase-free的DNase，除去DNA。处理方法：每µg DNA加入10U DNase（RNase-free），37℃保温15分钟，用Phenol-Chloroform抽提一次，在上清中加入0.1倍体积的3M Sodium Acetate (pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇沉淀RNA。
5）Promoter的选择：制备的探针用于S1核酸酶分析和Northern Blot时，所选用的RNA聚合酶转录出的产物必须和目标RNA互补。 6）转录产物低的原因：DNA纯度不够;DNA污染RNase; DNA中的过量的NaCl抑制RNA Polymerase的活性等。
