Klenow填补试剂盒 K471/472

Klenow Fill-in Kit

试剂盒组成：

注意：本试剂盒提供的试剂能做10个标准完全补平反应，或者20个部分补平反应，或者20个末端标记反应。末端标记时用户需自备同位素标记的核甘酸，或其它形式修饰的核甘酸。为提高标记效率，避免多次冻融dNTP。
主要用途：
1．部分填充基因组DNA片段，减少自身连接，提高基因组DNA文库的构建效率。
2．用于完全补平5’-末端突出的DNA片段，形成平末端，用于载体DNA的自身连接，及不同平末端分子之间的连接。
3．同位素，荧光素或生物素标记5’-末端突出的DNA片段，用于各种分子杂交实验。
用户需自备的试剂：

操作步骤：
一．完全填充反应
    注意：为提高填充的效率，DNA模板必须用酚-氯仿抽提或用有关试剂盒除去样品中的杂质。
1． 在1.5 ml Eppendorf 管中，按次序加入下列试剂，反应总体积为25ul：
< 2 ug   DNA
2.5ul 10X Fill-in Buffer
1.0ul 10 mM dATP
1.0ul 10 mM dCTP
1.0ul 10 mM dGTP
1.0ul 10 mM dTTP
1.0ul Klenow polymerase (5U)

加入使反应的总体积为25ul，用Tip混匀。
注意：
§ 无dNTP时，Klenow表现外切酶活性，故Klenow，总是在dNTP之后，通常是最后加到反应体系中，并迅速混匀。同时，不可过长地将反应混合物放在冰上。
§ 有些完全填充是不必要加入4种dNTP的，仅需加入与5’-末端突出的DNA序列互补的dNTP.如EcoRI 5’-末端突出的DNA序列为TTAA, 所以反应仅仅需要加入dATP和dTTP就可以完全补平。
2．室温或37C，放置15分钟。
3．加入25 ul STOP Solution, 混匀。
4．回收DNA。填充之后的DNA通常除去Klenow后，再用于下游的分子生物学实验。从反应体系中回收DNA的方法有多种。常用的方法是用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀。更为简单，快捷的方法是用NSBC-Sangon有关试剂盒回收，相关产品为SK111或SK131。
二．部分填充反应
    除所加入的dNTP的种类外，其它操作要求和注意事项同完全填充反应。所不同的地方是加入何种dNTP将取决于5’-末端突出的DNA序列和填充后需要得到的序列。用BamHI酶切产生的5’-末端突出的DNA为CTAG, 如要产生出5’-末端突出的DNA为AG的DNA片段，需要加入的dNTP为与CT互补的dGTP和dATP。 三．标准末端标记反应：
1．在1.5 ml Eppendorf 管中，按次序加入下列试剂，反应总体积为25ul：
< 2 ug   DNA
2.5ul 10X Fill-in Buffer
1.0ul 10 mM dCTP
1.0ul 10 mM dGTP
1.0ul 10 mM dTTP
30-50 uCi [a-32P]dATP
0.5ul Klenow polymerase (2.5U)
    加入使反应的总体积为25ul，用Tip混匀。
2．室温或37C，放置15分钟。
3．70C 保温5-10分钟灭活。

4.Sephadex G-50离心除去未掺入的核甘酸。探针可以立即使用或-20C保存