MmulV RT/PCR试剂盒-M K431M/432M

MMuLV RT/PCR Kit

试剂盒组成：

注意：所有试剂必须在-20℃保存。
简介：
   本试剂盒提供的试剂能从微量的poly(A)+ mRNA或总RNA中高效率的合成出cDNA第一链。MMLV Reverse Transcriptase是已知反转录酶中RNA反转录活性最强的一种。它能非常有效地以RNA为模板，在Oligo(dT) primer, Random Primers或其它特定的引物与RNA 退火后，从引物的3’-末端合成与RNA互补的DNA（cDNA第一链）。第一链cDNA可以立即用试剂盒提供Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。
准备工作：
l   用0.1%DEPC水过夜室温或37C处理1.5 ml Eppendorf 管和取液用10ml, 200ml和1 ml Tip, 高温蒸气灭菌，80℃烘干备用。
l   制备RNA模板。总RNA和mRNA均可以作为First-Strand cDNA合成的模板材料。本试剂盒每次反应需要500ng-2mg左右 总RNA或者25-50ng左右的mRNA。RNA溶于DEPC－H2O，体积小于8ml。
First-Strand cDNA合成：
注意：戴手套进行以下操作，严防RNase污染。
1．在1.5ml Eppendorf管中加入500ng-2mg 总RNA, 或25-50ng poly(A)+ mRNA。加入DEPC－H2O使总体积为8ml。
2． 加入0.5ml Ribonuclease inhibitor, 2ml Oligo(dT)18 primer，或2ml Random primers。小心混匀。
3．65℃保温５分钟。
4．室温放置10分钟。室温高速离心5秒钟，将所有溶液收集到管底。
5．按次序分别加入下列试剂：
             4 ml  5X First-Strand Buffer
             0.5ml  Ribonuclease inhibitor

2 ml   dNTP mix
            2 ml   DTT
            1 ml   MMuLV Reverse Transcriptase
注意：引物如何选用取决RNA模板的类型。Oligo(dT)18引物用于RNA 3’-末端有poly(A)+结构的cDNA合成，合成效率高，特异性好。Random primer则适用各种RNA,合成效率高，通用性好，但特异性较差，对RNA模板的质量要求较高，通常要求RNA模板无DNA污染。如果合成的cDNA仅仅用于扩增特定的基因，合成cDNA第一链的引物也可以是用户特定的引物，序列与RNA互补。
6． 小心混匀，37℃保温１小时。
7． 90℃处理５分钟。冰上冷却，室温高速离心5秒钟，将所有溶液收集到管底。
8． 用于PCR扩增或-20C保存备用。
PCR扩增1st strand cDNA
1. 将1-5ml 1st strand cDNA反应液转移到合适的无菌薄壁PCR管中。注意：制备的1st strand cDNA可以不纯化直接用作PCR模板，用量为1-5ml。如使用过量， 1st strand cDNA合成反应体系中的盐和Random primers将会抑制Taq DNA聚合酶的活性。如果有必要cDNA 1st strand纯化，可按下列方式纯化：cDNA合成反应结束后（步骤６），在反应体系中加入RNase A, 37℃保温10分钟，用BBST 3S柱(K141)回收cDNA。　
2. 按次序加入下列试剂：
                    5 ml  10X PCR Buffer
                    1 ml   dNTP mix
                    2 ml   25 mM Primer #1 (用户自备)
                    2 ml   25 mM Primer #2 (用户自备)
                    x ml   H20 (使反应总体积为49 ml)
                    1 ml   Taq DNA polymerase
3. 混匀，在液面上加50ml矿物油。
4. 扩增反应。根据用户引物的退火温和所扩增基因在原组织或细胞中的拷贝数，参考Taq DNA polymerase的技术参数，设定扩增条件。具体说明参见Taq DNA聚合酶说明书。通常循环30-35次。
5. DNA扩增产物用Agarose电泳和EB染色观测。