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cDNA第一链合成试剂盒-M K401M/402M

First-Strand cDNA Synthesis Kit

CAT#	SIZE	PRICE（￥）
K401M	10次	400
K402M	50次	1200

试剂盒组成：

Material Provided	K401M (10次)	K402M (50次)
MMLV Reverse Transcriptase 200U/ml 5X First-Strand Buffer Random primer (0.1mg/ml) DTT (100 mM) Oligo(dT)18 primer (0.1mg/ml) Ribonuclease Inhibitor (40U/ml) dNTPmix (10 mM each) DEPC-treated Water Protocol	2000 units 50 ml 30 ml 30 ml 30 ml 400 units 50 ml 500 ml 1份	2X 5000units 250 ml 120 ml 120 ml 120 ml 2000 units 200 ml 1 ml 1份

注意：所有试剂必须在-20℃保注意：所有试剂必须在-20℃保存。
简介：

            本试剂盒提供的试剂能从微量的poly(A)+ mRNA或总RNA中高效率的合成出cDNA第一链。MMLV Reverse Transcriptase是已知反转录酶中RNA反转录活性最强的一种。它能非常有效地以RNA为模板，在Oligo(dT) primer, Random Primers或其它特定的引物与RNA 退火后，从引物的3’-末端合成与RNA互补的DNA（cDNA第一链）。第一链cDNA可以用于RT-PCR, cDNA库构建等实验。
准备工作：
1）用0.1%DEPC水过夜室温或37C处理1.5 ml Eppendorf 管和取液用10ml, 200ml和1 ml Tip, 高温蒸气灭菌，80℃烘干备用。
2）制备RNA模板。总RNA和mRNA均可以作为First-Strand cDNA合成的模板材料。本试剂盒每次反应需要500ng-2mg左右总RNA或者25-50ng左右的mRNA。RNA溶于DEPC－H2O，体积小于8ml。
First-Strand cDNA合成：
注意：戴手套进行以下操作，严防RNase污染。
１．在1.5ml Eppendorf管中加入500ng-2mg 总RNA, 或25-50ng poly(A)+ mRNA。加入DEPC－H2O使总体积为8ml，加入0.5ml Ribonuclease inhibitor。
２．加入2ml Oligo(dT)18 primer，或2ml Random primers。小心混匀。
３．65℃保温５分钟。
４．室温放置10分钟。室温高速离心5秒钟，将所有溶液收集到管底。
５．按次序分别加入下列试剂：
    4 ml 5X First-Strand Buffer
    0.5 ml Ribonuclease inhibitor
    2 ml 100 mM DTT
    2 ml   dNTP mix
    1 ml   MMLV Re verse Transcriptase
６．小心混匀，37℃保温１小时。
７．90℃处理５分钟。冰上冷却，室温高速离心5秒钟，将所有溶液收集到管底。
８．用于PCR扩增或cDNA的2nd链的合成。
注意：
l  引物如何选用取决RNA模板的类型。Oligo(dT)18引物用于RNA 3’-末端有poly(A)+结构的cDNA合成，合成效率高，特异性好。Random primer则适用各种RNA,合成效率高，通用性好，但特异性较差，对RNA模板的质量要求较高，通常要求RNA模板无DNA污染。如果合成的cDNA仅仅用于扩增特定的基因，合成cDNA第一链的引物也可以是用户特定的引物，序列与RNA互补。

2 制备的cDNA可以不纯化直接用作PCR模板，用量为1-5ml。如使用过量，1st strand cDNA合成反应体系中的盐和Random primers将会抑制Taq DNA聚合酶的活性。

如果有必要cDNA 1st strand纯化，可按下列方式纯化：cDNA合成反应结束后（步骤６），在反应体系中加入RNase A, 37℃保温10分钟，用BBST3S柱(K141)回收cDNA