3S柱离心式快速总RNA/DNA植被试剂盒 K394/395

3S Quick Total RNA / DNA in One Miniprep Kit

准备工作：
注意事项：
(a)RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的RNase完全失活。RNase广泛存在于人的皮肤上，因此，制备RNA时必须戴手套。
(b)RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
1． 塑料制品、玻璃和金属物品的处理
(a)塑料制品：尽可能使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free 的塑料制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上处理后方可使用。处理方法如下：
(1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，在通风柜中小心使用。
(2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。

(3)℃下处理过夜。
(4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含用DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
(5)用合适的温度(80-90℃)烘拷至干燥。置于干净处备用。
(b)玻璃和金属物品
(c)250°C烘烤3小时以上。
表1.试剂盒组成：

注意事项：
a.在收到试剂盒后，应将RLT Solution取出存放于4ºC下。
b.RPE Solution 在首次使用前，必须加入等体积的无水乙醇，无水乙醇必须是新开封的， 保证无RNase污染。
l  为获得最佳的结果，采用的样品数量一定要合适。可以参考表2。
l  细胞培养物、细菌菌体、酵母以及真菌菌丝应该在对数生长期收集，动物和植物样品应该取生长旺盛的幼嫩部位。

用户需自备的试剂和材料：
无水乙醇，70%乙醇(DEPC-H2O配制) (植物和丝状真菌用)，PBS(动物细胞用)，液氮(植物和丝状真菌用)，RNase-free的Eppendorf管和Tips。

实验操作步骤
动物细胞的总DNA/RNA 抽提：
1．收集细胞
a. 悬浮培养细胞
依照表2提供的数据，300´g室温离心5分钟，彻底去上清，进行步骤2。
b. 单层培养细胞
单层培养细胞可以直接在培养瓶中进行裂解，也可以通过胰蛋白酶的消化收集细胞后再裂解。
蛋白酶消化细胞：倒掉培养基，用PBS洗涤细胞，然后用胰蛋白酶消化细胞。在细胞从培养瓶表面脱落以后，将细胞转移到离心管中，300´g离心5分钟，彻底去上清，进行步骤2。
直接在培养瓶中进行消化（直径可达10cm）：完全倒掉培养基，进行步骤2。
2．裂解细胞
按下表加350ml RLT,用振荡器或枪头混匀。

3．加等体积的70%的乙醇，用枪头混匀。
4．将3S柱放到一个2ml 的收集管中，将700ml 样品（样品中如果有沉淀，应将沉淀一起加到3S柱中）加到3S柱中，室温10000´g高速离心1分钟，倒去收集管中的废液，将3S柱放到同一收集管中。
5．加500ml RPE Solution加到柱子中,室温下高速离心1分钟；

如果需要得到所有的DNA和RNA，执行步骤6-8：

6．重复步骤5一次。
7．倒掉收集管中的废液，将柱子放入同一个收集管, 室温下高速离心1分钟。
8．将柱子放到一个无RNase污染的Eppendorf 管中，取100ml DEPC－H2O加到柱子中膜的中央，42℃水浴保温2分钟,室温下高速离心1分钟。 洗脱得到的为总RNA和DNA混合样品。可立即使用，也可存放在-20℃或-70℃备用。

如果需要分别得到DNA和RNA，执行步骤9-13：

9．取出柱子，放入干净的（最好是无RNase污染的Eppendorf 管）1.5ml收集管中，加入50ml DES I液，让离心管盖子开着，42℃水浴保温2分钟；盖上离心管盖，室温下高速离心1分钟。收集管中的样品即为基因组DNA。注意：通常情况下从本步骤得到的DNA的量已足够用于PCR反应，Southern杂交等实验。
10．将柱子放回2ml收集管，在柱子中加入450ml DES II溶液，42℃水浴保温2分钟，室温下高速离心1分钟。根据需要是否保留洗脱液。

注意：洗脱液中仍含有部分DNA，它可以与步骤6中的DNA样品一起按下发予以合并回收
(1)并步骤6，7的洗脱液，加入250ml无水乙醇，混匀，转移到一根新的3S柱子中，柱子放入2ml收集管中，室温放置2分钟。
(2)用台式离心机，室温下高速离心1分钟。
(3)取下柱子，弃去管中的废液，放回柱子，在柱子中加入500ml RPE Solution，室温下高速离心1分钟。
(4)弃去收集管中的废液，将柱子放入同一个收集管，室温下高速离心1分钟除去残留的RPE液。
(5)取出柱子，放入干净的（最好是RNase污染的Eppendorf 管）1.5ml收集管中，在柱子膜的中央加入30-50ml水，让离心管盖子开着，42℃水浴保温2分钟；盖上离心管盖，室温下高速离心1分钟。收集管中的样品即为基因组DNA。洗脱的DNA可立即使用，也可以-20℃或-70℃保存备用。如需要保证DNA的完整性，短期也可以4℃保存。
11．将柱子放回2ml收集管, 加500ml RPE Solution加到柱子中，高速离心1分钟。

12．倒掉收集管中的废液，将柱子放入同一个收集管, 室温高速离心2分钟以除去残留的RPE Solution。
13．将柱子放到一个无RNase污染的Eppendorf 管中，取30－50ml DEPC－H2O加到柱子中膜的中央，42℃水浴保温2分钟,室温下高速离心1分钟。 洗脱得到的RNA可立即使用，也可存放在-20℃或-70℃备用。

细菌总DNA/RNA的抽提：
1．   将适量的指数生长期细菌（最多可达1×109）4℃下5,000´g离心3－5分钟，彻底弃上清培养基。
2．   加100ml含溶菌酶的TE，用振荡器混匀，对于格兰氏阳性和格兰氏阴性菌酶解时间的要求是不一样的，详见下表。

3．   加350ml RLT Solution，剧烈振荡，以保证细菌的充分裂解，如果有不溶物的存在，高速离心两分钟，取上清液进行下一步试验。
4．加250ml无水乙醇到裂解液中，用枪头混匀，注意即使出现沉淀也不要离心。
5．以下步骤同动物细胞的总DNA/RNA 抽提步骤5-10。

植物细胞、组织和丝状真菌总DNA/RNA的抽提：
1．样品在液氮下碾磨，在液氮未挥发光前粉末转移到Eppendoff管中，保证样品未融解。
2．加450ml RLT Solution到样品中，样品最多100mg。剧烈振荡混匀。
在56℃下放置1-3分钟，有利于样品的裂解，但淀粉含量高的样品不能在高温下裂解，否则会出现团状物。
3．加0.5倍体积的无水乙醇，用枪头混匀。
4．将3S柱放到一个2ml 的收集管中，将700ml样品（样品中如果有沉淀，应将沉淀一起加到3S柱中）加到3S柱中，室温,10000´g高速离心1分钟。

总RNA的纯化：
1．  将抽提得到的RNA样品用DEPC-H2O调节到100ml，加350ml RLT液，充分混匀。
2．  加250ml无水乙醇，用枪头混匀，注意即使出现沉淀也不要离心。
3．  将3S柱放入2ml收集管中，将700ml样品连同沉淀物一起上到3S柱中，高速离心1分钟，倒掉收集管中的液体，将柱子放入同一个收集管。
4．  加500ml RPE Solution加到柱子中，室温下10000´g高速离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将柱子放入同一个收集管。
5．  加500ml RPE Solution加到柱子中，室温,10000´g高速离心1分钟。
6．  倒掉收集管中的废液，将柱子放入同一个收集管, 室温高速离心2分钟以除去残留的RPE Solution。
7．  将柱子放到一个无RNase污染的Eppendorf 管中，取30－50ml DEPC－H2O加到柱子膜的中央，50℃下放置2分钟（此温度下有利于RNA的洗脱），高速离心1分钟。

RNA样品的储存，定量和纯度的确定：
储存：洗脱得到的RNA可立即使用，也可存放在-20℃或-70℃一年以上。不得反复冻融。
定量：样品用RNase-free水稀释，测定A260,按1 A260 = 40 mg/ml计算产率。注意稀释后样品的吸收值必须大于0.15,否则不准确。
纯度：测定A260/280.　该比值受稀释样品用溶液的pH影响。如需要准确的比值，用10 mM Tris-HCl pH7.5 稀释样品。

纯化过程中可能出现的问题及解决方法: