HiFi PCR Amplication Kit高保真PCR扩增试剂盒 K381/K382
Cat# |
Size |
Price(￥) |
K381 |
100 |
300 |
K382 |
500 |
950 |
试剂盒组成：
Components and Size |
K381 |
K382 |
Pfu DNA Polymerase（5 U/ml） |
200 U |
1000 U |
产品说明：本试剂盒提供DNA高保真扩增所需要的基本试剂。DNA扩增时，用户需要自行准备模板和扩增所需要的引物。高温嗜热Pfu DNA聚合酶主要用于对保真度要求非常高的DNA扩增，这些扩增要求扩增的产物中不能出现突变等错误。Taq DNA聚合酶的扩增性能很强，但是用Taq扩增的PCR产物中有难以避免的随机突变。Pfu DNA聚合酶除了5’-3'的聚合特性外，还有3’-5’'端外切酶活性, 具有校正DNA扩增过程中突变。Pfu DNA的长片段扩增的能力不及Taq DNA聚合酶，客户如果用于长链PCR扩增，可选用SNBC的SuperTaq(产品编号E2400)或者Taq Plus DNA 聚合酶(产品编号E2300)。
反应缓冲液：
10×Pfu DNA Pol. Buffer 反应缓冲液 W/Mg: 100 mM KCl, 160 mM (NH4)2SO4, 20mM MgSO4, 100 mM Tris-HCl, pH9.0, 0.5% NP-40。
质量控制：
经过检测无外源核酸酶活性；SDS-PAGE检测纯度大于95%；PCR方法检测无外源DNA; 能从50ng lambda 模板中特异性扩增出1kb 和2.2kb 的单拷贝基因。
储存条件：
Taq DNA聚合酶成品保存于50 mM Tris-HCl, pH8.2, 0.1 mM EDTA, 0.1% Tween 20, 0.1% NP-40, 1mM DTT 和50% glycerol，-20°C,一年以上。
主要应用：
常规PCR
基因的高保真扩增，克隆和表达
基因的定点突变
细胞内基因突变分析。
主要技术参数：
使用方法：
一般原则：
DNA扩增（PCR）时，50ml标准反应体系需Pfu DNA聚合酶2.5 U, 模板10ng-500ng，Mg2+浓度为 1.5-3.0 mM, dNTP的工作浓度为100-300mM, 循环次数根据模板的特性，通常在20-35个循环。其它参数设定参照Pfu主要技术参数。
以下方法仅仅供参考：
1) 按下表中所列次序在冰上在0.2或0.5ml超薄PCR管中混合有关试剂
Components |
Volume,final conc (f.c) |
Buffer |
5ml |
2) 混匀后，加入50ml矿物油。
3) 按下表的条件立即进行PCR。
循环次数 |
反应阶段 |
温度 |
时间 |
1 |
变性 |
92-94°C |
2 分钟 |
20-35 |
变性 |
92-94°C |
30秒 |
1 |
合成 |
72°C |
7分钟 |
注意事项：
1.Pfu扩增效率通常比Taq酶差，这是由于Pfu具有3’-5’的外切酶活性（高保真性）所引起的，不是由于Pfu酶的质量不稳定所致。Pfu扩增1.5kb以下的DNA片段和Taq没有多大差别。
2.10×Pfu PCR Buffer中已含有Mg2+，用该缓冲能保证扩增产物的保真性。提高反应体系的pH和Mg2+浓度能部分提高DNA扩增的产率，但产物的保真性将有所下降。不提倡用Taq PCR反应缓冲代替Pfu缓冲做高保真扩增。
3.用Pfu扩增时，引物的纯度要求较高，长度要求大于18 base, Tm在55-80℃之间。引物的浓度在0.1-0.5mM之间，比Taq略高。Pfu具有3’-5’的外切酶活性可能会降解引物，特别是溶液中没有dNTP的情况下。所以，Pfu必须是最后加入到反应体系中，并立即进行PCR反应。
4.Pfu的热稳定性比Taq酶高，对于GC含量很高的模板，变性温度可以提高到98℃,而不会影响Pfu的活性。
位来访者