3S柱离心式细菌总RNA抽提试剂盒 K3630/3640

3S Spin Bacterial Total RNA Miniprep Super Kit

注意事项：
(a)RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的RNase完全失活。RNase广泛存在于人的皮肤上，因此，制备RNA时必须戴手套。
(b)RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。

1．塑料制品、玻璃和金属物品的处理
(a)塑料制品：尽可能使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free 的塑料制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上处理后方可使用。处理方法如下：
(1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，在通风柜中小心使用。
(2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
(3)37℃下处理过夜。
(4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含用DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
(5)用合适的温度(80-90℃)烘拷至干燥。置于干净处备用。

(b)玻璃和金属物品250°C烘烤3小时以上。

表1.试剂盒组成：

注意事项：
a. 在收到试剂盒后，应将RLT Solution取出存放于4ºC下。
b. RPE Solution 在首次使用前，必须加入等体积的无水乙醇，无水乙醇必须是新开封的， 保证无RNase污染。
c. 融菌酶使用前按下列要求处理: K3630: Lysozyme 用1.5 ml Lysozyme Dilution A溶解后, 再加入1.5ml Lysozyme Stablizer,混匀后-20度保存.  K3640: Lysozyme 用7.5 ml Lysozyme Dilution A溶解后, 再加入7.5ml Lysozyme Stablizer,混匀后-20度保存.
表2.3S柱的特性：

用户需自备的试剂和材料：
无水乙醇，70%乙醇(DEPC-H2O配制)，RNase-free的Eppendorf管和Tips, 离心机等。

细菌总RNA的抽提：

1.将适量的指数生长期细菌（最多可达1×109）4℃下5,000´g离心3－5分钟，彻底弃上清培养基。
2．按要求准备Lyzosome.。
3．细菌菌体用配制好的100μl溶菌酶悬浮，用振荡器混匀，室温放置5-10分钟。
4．加350ml RLT Solution，剧烈振荡，以保证细菌的充分裂解。
5．高速离心两分钟，将上清转移到无菌RNase free的1.5ml离心管中。
6．加250ml无水乙醇到裂解液中，用枪头混匀，注意即使出现沉淀也不要离心。
7．将3S柱放到一个2ml 的收集管中，将700ml 样品（样品中如果有沉淀，应将沉淀一起加到3S柱中）加到3S柱中，室温10000´g高速离心1分钟，倒去收集管中的废液，将3S柱放到同一收集管中。
8．加200ml RW Solution加到柱子中，42℃水浴保温2分钟,室温下高速离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将柱子放入同一个收集管。
9．加300ml RW Solution加到柱子中，42℃水浴保温2分钟,室温下高速离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将柱子放入同一个收集管。
10．加500ml RPE Solution加到柱子中，高速离心1分钟。
11．倒掉收集管中的废液，将柱子放入同一个收集管, 室温高速离心2分钟以除去残留的RPE Solution。
12．洗脱得到的RNA可立即使用，也可存放在-20℃或-70℃备用。

RNA样品的储存，定量和纯度的确定：
储存：洗脱得到的RNA可立即使用，也可存放在-20℃或-70℃一年以上。不得反复冻融。
定量：样品用RNase-free水稀释，测定A260,按1 A260 = 40 mg/ml计算产率。注意稀释后样品的吸收值必须大于0.15,否则不准确。
纯度：测定A260/280.　该比值受稀释样品用溶液的pH影响。如需要准确的比值，用10 mM Tris-HCl pH7.5 稀释样品。

纯化过程中可能出现的问题及解决方法: