3S柱式细胞和组织总RNA抽提试剂盒V2.0 K361/362

3S Total RNA Miniprep Super Kit

准备工作：
注意事项：
(a) RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的RNase完全失活。RNase广泛存在于人的皮肤上，因此，制备RNA时必须戴手套。
(b) RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
1．塑料制品、玻璃和金属物品的处理
(a)塑料制品：尽可能使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free 的塑料制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上处理后方可使用。处理方法如下：
(1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，在通风柜中小心使用。
(2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。

(3)37℃下处理过夜。
(4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含用DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
(5)用合适的温度(80-90℃)烘拷至干燥。置于干净处备用。
(b)玻璃和金属物品
250°C烘烤3小时以上。

表1.试剂盒组成：

注意事项：

.在收到试剂盒后，应将RLT Solution取出存放于4ºC下。
b.RPE Solution 在首次使用前，必须加入等体积的无水乙醇，无水乙醇必须是新开封的， 保证无RNase污染。
    获得最佳的结果，采用的样品数量一定要合适。可以参考表2。
    培养物、细菌菌体、酵母以及真菌菌丝应该在对数生长期收集，动物和植物样品应该取生长旺盛的幼嫩部位。
    抽提RNA的器皿，耗材以及试剂都要保证无RNase污染。

表2.3S柱的特性

用户需自备的试剂和材料：
无水乙醇，70%乙醇(DEPC-H2O配制) (植物和丝状真菌用)，PBS(动物细胞用)，液氮(植物和丝状真菌用)，RNase-free的Eppendorf管和Tips。

基本原理：
幼嫩组织和对数生长期的细胞生长旺盛，含有大量的RNA。RLT Solution能使细胞裂解，释放出RNA的同时灭活RNase。RNA能选择性的与3S柱中的膜结合，而蛋白等杂质不能结合，经RW Solution和RPE Solution的几步洗涤后结合在膜上的RNA用DEPC－H2O洗脱，可用于各种分子生物学实验。

动物细胞的总RNA 抽提：
1．收集细胞
a. 悬浮培养细胞
依照表2提供的数据，300´g室温离心5分钟，彻底去上清，进行步骤2。
b. 单层培养细胞
单层培养细胞可以直接在培养瓶中进行裂解，也可以通过胰蛋白酶的消化收集细胞后再裂解。
蛋白酶消化细胞：倒掉培养基，用PBS洗涤细胞，然后用胰蛋白酶消化细胞。在细胞从培养瓶表面脱落以后，将细胞转移到离心管中，300´g离心5分钟，彻底去上清，进行步骤2。
直接在培养瓶中进行消化（直径可达10cm）：完全倒掉培养基，进行步骤2。
2．裂解细胞

按下表加350ml RLT,用振荡器或枪头混匀。

3．用匀浆器匀浆30秒或用20-G（Ф0.9mm）针头抽5次。
4．将样品转移到Rnase free的离心管里，12000转/分离心5分钟。
5．将上清小心转移到Rnase free的离心管里，加等体积的70%的乙醇，用枪头混匀。
6．将3S柱放到一个2ml 的收集管中，将700ml 样品（样品中如果有沉淀，应将沉淀一起加到3S柱中）加到3S柱中，室温10000´g高速离心1分钟，倒去收集管中的废液，将3S柱放到同一收集管中。
7．加200ml RW Solution加到柱子中，42℃水浴保温2分钟,室温下高速离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将柱子放入同一个收集管。
8．加300ml RW Solution加到柱子中，42℃水浴保温2分钟,室温下高速离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将柱子放入同一个收集管。
9．加500ml RPE Solution加到柱子中，高速离心1分钟。
10．倒掉收集管中的废液，将柱子放入同一个收集管, 室温高速离心2分钟以除去残留的RPE Solution。
11．将柱子放到一个无RNase污染的Eppendorf 管中，取30－50ml DEPC－H2O加到柱子中膜的中央，42℃水浴保温2分钟,室温下高速离心1分钟。 洗脱得到的RNA可立即使用，也可存放在-20℃或-70℃备用。

细菌总RNA的抽提：
1．将适量的指数生长期细菌（最多可达1×109）4℃下5,000´g离心3－5分钟，彻底弃上清培养基。
2．加100μl含溶菌酶的TE，用振荡器混匀，对于格兰氏阳性和格兰氏阴性菌酶解时间的要求是不一样的，详见下表。

3．将样品转移到Rnase free的离心管里，12000转/分离心5分钟。
4．将上清小心转移到Rnase free的离心管里，加350ml RLT Solution，剧烈振荡，以保证细菌的充分裂解，如果有不溶物的存在，高速离心两分钟，取上清液进行下一步试验。
5．加250ml无水乙醇到裂解液中，用枪头混匀，注意即使出现沉淀也不要离心。
以下步骤同动物细胞的总RNA 抽提步骤6-11。

植物细胞、组织和丝状真菌总RNA的抽提：
1．样品在液氮下碾磨，在液氮未挥发光前粉末转移到Eppendoff管中，保证样品未融解。
2．加450ml RLT Solution到样品中，样品最多100mg。剧烈振荡混匀。
在56℃下放置1-3分钟，有利于样品的裂解，但淀粉含量高的样品不能在高温下裂解，否则会出现团状物。
3．将样品转移到Rnase free的离心管里，12000转/分离心10分钟。
4．将上清小心转移到Rnase free的离心管里，加0.5倍体积的无水乙醇，用枪头混匀。
5．将3S柱放到一个2ml 的收集管中，将700ml样品（样品中如果有沉淀，应将沉淀一起加到3S柱中）加到3S柱中，室温,10000´g高速离心1分钟。
以下步骤同动物细胞的总RNA 抽提步骤6-11。
动物组织总RNA的抽提：
1．动物组织总RNA的制备，样品的取材和保存非常关键。取下的动物组织需要立即使用，如果不使用需要保存在液氮中。
2．将组织块切成小块，转移到匀浆器中，按没100-200mg组织加500-1000ml RLT溶液，冰里匀浆。
3．将匀浆液转移到Rnase free的离心管里，12000转/分离心10分钟。

总RNA的纯化：
1．将抽提得到的RNA样品用DEPC-H2O调节到100μl，加350ml RLT液，充分混匀。
2．加250ml无水乙醇，用枪头混匀，注意即使出现沉淀也不要离心。
3．将3S柱放入2ml收集管中，将700ml样品连同沉淀物一起上到3S柱中，高速离心1分钟，倒掉收集管中的液体，将柱子放入同一个收集管。
4．加500ml RPE Solution加到柱子中，室温下10000´g高速离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将柱子放入同一个收集管。
5．加500ml RPE Solution加到柱子中，室温,10000´g高速离心1分钟。
6．倒掉收集管中的废液，将柱子放入同一个收集管, 室温高速离心1分钟以除去残留的RPE Solution。
7．将柱子放到一个无RNase污染的Eppendorf 管中，取30－50ml DEPC－H2O加到柱子膜的中央，50℃下放置2分钟（此温度下有利于RNA的洗脱），高速离心1分钟。
RNA样品的储存，定量和纯度的确定：
储存：洗脱得到的RNA可立即使用，也可存放在-20℃或-70℃一年以上。不得反复冻融。
定量：样品用RNase-free水稀释，测定A260,按1 A260 = 40 mg/ml计算产率。注意稀释后样品的吸收值必须大于0.15,否则不准确。
纯度：测定A260/280.　该比值受稀释样品用溶液的pH影响。如需要准确的比值，用10 mM Tris-HCl pH7.5 稀释样品。

纯化过程中可能出现的问题及解决方法: