TriBlue(用于一步法快速抽提RNA) K311/312

介绍：
研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol适用于从多种组织和细胞中快速分离总RNA。
准备工作：
1．注意事项：
(a) RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，制备RNA时必须戴手套。
(b) RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
2．塑料制品、玻璃和金属物品的处理
(a) 塑料制品：尽可能使用无菌，一次性塑料制品。已标明RNase-free 的塑料制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上处理后方可使用。处理方法如下：
(1) 在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，在通风柜中小心使用。
(2) 将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。

(3) 在通风柜中37℃或室温下处理过夜。
(4) 将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
(5) 用合适的温度(80-90℃)烘拷至干燥。置于干净处备用。
（b）玻璃和金属物品250°C烘烤3小时以上。

抽提总RNA时用户须自备的试剂：
DEPC, 氯仿, 异戊醇, 异丙醇，无水乙醇，70% 乙醇, DEPC-H2O, 糖原

使用方法：
1．组织样品：用液氮速冻，将组织磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，把粉末转移到eppendorf 管中，每100mg组织加1.0ml的 Trizol。细胞样品：用常规方法收集细胞，按106-107个细胞，加入1.0 ml Trizol。
注意：如果组织的量（1-10mg）或细胞数很少（102-104），在样品中加入800ml的Trizol，用枪头反复抽吸混匀，再加入糖原(终浓度为250mg/ml)，剧烈振荡或用匀浆器匀浆。
2．用1ml 针筒，26号针头抽吸匀浆液以剪切基因组DNA两次，然后用同一根针筒将样品转移到无菌1.5ml Eppendorf管中。注意：此步操作并非一定要做。
3．加入200ml氯仿/异戊醇 (24∶1)或氯仿，剧烈振荡混匀30秒。
4．用台式离心机，12000转/分，室温离心5分钟。
5．将上清液小心转移到RNase-free 1.5ml离心管里，加入与上清等体积的异丙醇，室温下放置5分钟。
注意：不要吸取任何中间层物质，否则会出现Genomic DNA污染。
6．用台式离心机，12000转/分，室温离心5分钟。
7．小心移去上清液，防止沉淀丢失。
8．用70%酒精洗涤两次，每次700ml，12000转/分，室温离心2分钟。
9．尽可能彻底地吸走上清，防止丢失RNA沉淀。
10. 真空离心干燥3-5分钟，或放在室温下将酒精空干。
11. 沉淀用30-50ml DEPC-H2O溶解。如发现沉淀很难溶解，68°C处理10分钟。对于 胰腺,肾等组织中RNase含有很高，沉淀用100%去离子Formamide溶解。