BCA 蛋白质定量测定试剂盒 K3000/3001/3002 

BCA-100 Protein Quantitative Analysis Kit

原理：蛋白质中的肽键、半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、酪氨酸将Cu2+还原成Cu+, Cu+与Solution A中的Bicichoninic Acid (BCA)形成有色复合物。通过测定有色复合物562nm的可见光吸收溶液蛋白质的浓度。
注意：
1.反应颜色的深浅除了与样品的蛋白质浓度相关外，还与反应的温度有关。如果样品的浓度较高（>50μg/ml），反应温度一般采用37度,但是色氨酸、酪氨酸和肽键在该温度下得不到彻底的氧化。如果样品蛋白质的浓度较低（<50μg），反应的温度为60度，该温度下，色氨酸、酪氨酸和肽键得到充分氧化，大大提高检测灵敏度。
2.37度该方法检测的蛋白质浓度范围20μg-500μg/ml；60度（增强法）可以检测的5ug/ml。
3.Solution A和B在室温的稳定期至少1年以上。
4.化学兼容性（下列物质如果低于指定浓度将不会干扰测定）：5% NP40、10mM EDTA、1 M NaCl、0.2M NaAc, pH5.5、5% SDS, 5% Brij-35、5% CHAPS、0.1M HEPES、4M Guanidine-HCl、5% Triton X-100、3M Urea、250 mM Tris、100mM PIPES、50mM Imidazole、10mM Glucose, 10% Glycerol(Fresh)、40% Sucrose, 50mM NaOH,1mMDTT,1mMDTE,1.5mM（NH4）2SO4.
5.下列化学试剂将干扰测定： Cysteine, EGTA, Phenol Red,Hydrazides等。通过透析，层析过滤，TCA沉淀，如果样品浓度高稀释等手段降低干扰。
6.Solution A和Solution B按比例混匀后的混合物，需要在24小时内使用。
7.使用0.5ml（玻璃）或更小的比色杯，可以节省试剂和增加检测的样品数。
8.标准BSA的标定：1OD280=0.66。

测定方法(试管法)：
1.据样品的数目和蛋白质的浓度，准备37C或60C水浴；按每个反应使用0.5ml Solution A, 0.01ml Solution B准备A+B混合液：50份 Solution A + 1份 Solution B，混匀后使用。该混合液需要在24小时内用完。注意：每个测定要做2-3个平行反应，即每个样品需要1.5ml Solution A和0.03ml Solution B。注意：本处采用的比色体系需要用0.5ml的比色杯；如果没有0.5ml比色杯，反应体系需要放大到实验将采用的比色杯准确读数所需要的体积。
2.BSA标准品和样品的准备：样品用水或其它不干扰显色反应的缓冲配置，使待测定的浓度位于标准曲线的线性部分。每个反应准备3个平行测定。标准曲线一般5-6个点即可，根据样品的浓度确定各点的具体浓度。稀释BSA时,可以用水，最好采用与样品一致或近似的溶液。如待测定的浓度为200μg/ml左右，按下表的次序加入BSA标准或样品及Solution A+B混合物，混匀。

未知样品浓度可以从标准曲线中查得, 实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。
3.可以在1.5ml Eppendorf管内做反应。在管壁上依次标上序列号，按上表加样品，注意：每次反应都需要做一个和未知样品溶液相同的空白做对照。
4.保温。对于蛋白质在20ug-500ug/ml采用标准反应：37度保温30分钟；对于5-20μg/ml采用增强法反应：60度保温30分钟。注意：保温前需要将离心管盖盖上。

5.保温结束后，取出反应管，冷却到室温。
6.测定562nm的光吸收。注意：OD值的测定需要在保温接受后一小时内完成。60度保温结束后需要离心将盖子上的水蒸汽收集到管内。
7.标准曲线的绘制。注意：数据处理时需要去除明显错误的值。未知样品浓度可以从标准曲线中查得, 实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。如果是计算机绘制得曲线，可以从计算机给出的线性方程式计算出未知样品的浓度。注意：实际操作时不必每次都做标准曲线，可以做一两个标准样品，和标准曲线比较得出浓度系数。未知样品的实际浓度=从标准曲线中得到的浓度*浓度系数。

测定方法(96孔板)：
1.据样品的数目和蛋白质的浓度，准备37C或60C恒温箱；按每给反应使用200ulSolution A, 4ul Solution B准备A+B混合液：50份 Solution A + 1份 Solution B，混匀后使用。该混合液需要在24小时内用完。注意：每给测定要做2-3个平行反应，即每个样品需要0.6ml Solution A和0.012ml Solution B。
2.BSA标准品和样品的准备：样品用水或其它不干扰显色反应的缓冲配置，使待测定的浓度位于标准曲线的线性部分。每个反应准备3个平行测定。标准曲线一般5-6个点即可，根据样品的浓度确定各点的具体浓度。稀释BSA时,可以用水，最好采用与样品一致或近似的溶液。如待测定的浓度为200μg/ml左右，按下表的次序加入BSA标准或样品及Solution A+B混合物，混匀。

未知样品浓度可以从标准曲线中查得, 实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。

3.在每个孔中加入25ul样品，然后加入200ul A+B混合液,盖上盖子混合30秒。
4.盖上盖子，37度保温30分钟。
5.冷却到室温，
6.测定562nm的光吸收。注意：OD值的测定需要在保温接受后一小时内完成。