PCR产物添A试剂盒 k291/292

PCR A-Tailing System

试剂盒组成:

注意事项:
(a) 10X A-tailing Buffer中已含有Mg2+，通常情况下不需要调整Mg2+的浓度；dATPmix是专门为3’A-Tailing反应配制，不能用于常规的DNA扩增。
主要用途：
１）在由Pfu等高保真DNA聚合酶扩增的PCR产物两端分别补上单个脱氧腺嘌呤A,，间接将PCR产物克隆到T载体上
２）在任何平端DNA两端分别加上单个A, 便于克隆和分析
主要特点：
1）试剂盒中含有dATPmix, 一种非等量4种dNTP混合物，保证在DNA平末端添上单个A的同时，能将PCR扩增产物中不完整的片段补平并加上A, 保证PCR产物的一致性。
2）快速，15分钟就可以完成tailing工作
基本原理：
    基因片段用Pfu扩增得到的产物为平末端，直接克隆比较困难。做T/A克隆时，需要在其3’末端添加单个碱基A。本试剂盒提供了供在平端添加单个A所需的所有试剂，大大方便后续的T/A克隆及序列分析。
有关方法：
1. 模板准备

１）由高保真DNA聚合酶如Pfu，Pwo，DeepVent等扩增而来的PCR产物。
２）一些限制性内切酶如EcoRV, SmaI等酶切产生的平端DNA片段。
３）粘端DNA用DNA聚合酶补平后的片段。
2. DNA片段添A反应
1) 100 ng DNA，加入５ul 10X A-Tailing Buffer, 1ul dATPmix, 2.5U Taq DNA Polymerase, 加入适当的无菌水使反应的总体积为50 ul，混匀。
2) 72℃保温，5-10分钟。
3) 产物回收（步骤3）。也可以-20℃保存。
3. 从A-tailing反应体系中回收DNA (需要购买K151)
(1)  在步骤３的50ul 反应液中，加入250ul Solution S和30ul Golden Beads（Golden Beads易沉降, 要充分混匀后吸取），混匀，室温放置２分钟，间或混几次。
(2)  室温高速离心（12000 rpm）1分钟, 小心吸掉上清,不要移走Golden Beads。
(3)  用500ul Wash Solution 将Golden Beads悬浮起来。对大片段DNA, 为保证DNA的完整性，不要用Tip悬浮Beads。用手指弹离心管底部就可以将Beads悬浮起来，不必用Tip。室温高速离心1分钟。
(4)  小心吸掉上清，用500ul Wash Solution将Golden Beads悬浮起来，室温高速离心1分钟。
(5)  小心吸掉上清。管壁上的液滴高速离心1分钟，用枪头彻底吸走溶液，并用枪头搅动Beads使其分散并便于干燥；离心管倒置，室温干燥15分钟或打开盖子55C保温5分钟，但应注意不要使Beads完全干燥。
(6)  用20ul TE或水将Golden Beads悬浮起来, 室温或37-50℃放置2分钟。中途混匀若干次。
(7)  高速离心1分钟，小心将洗脱液移到干净的1.5 ml离心管中，注意不要吸取Beads。
(8)  高速离心1分钟，除去洗脱液中可能存在的微量Beads。样品可立即使用，也可以低温保存备用。
4. T/A连接
本试剂盒中提供的T载体为pUCm-T载体，有关该载体的技术资料见pUCm-T产品说明。连接方式如下：