Go3S柱离心式基因组DNA小量抽提试剂盒 K201/202/203

3S Spin Genomic DNA Miniprep Kit V3.0

试剂盒组成：

注：
(a)      首次使用前，必须在Wash Solution瓶中加入50ml无水乙醇，充分混匀后使用。每次使用后将瓶盖盖紧，以保持Wash Solution中的乙醇含量
(b)     Proteinase K使用前每6mg加入150µl H2O,短时间4℃保存,长时间-20度保存备用。不得Proteinase K直接加入到Digestion Buffer中，以免酶失活。
基本原理：
         该试剂盒的核心是能特异吸附DNA的3S柱。3S柱是一种能放入普通1.5ml和2.0ml eppendorf管中的离心式小柱，柱子的底部有惰性大分子材料，它能由选择性吸附核酸物质，但不吸附蛋白质、多糖和其它非核酸类物质。制备基因组DNA时，首先根据要求准备样品，后用Proteinase K和去污剂裂解组织和细胞，释放出基因组DNA。3S用于吸附基因组DNA, 经简单的洗涤步骤除去非特异性结合的杂质, 然后用Elution Buffer, TE 或者水洗脱。
质量控制：
基因组DNA抽提效果由从大肠杆菌细胞中制备细菌基因组DNA和从人血液中抽提人基因组DNA,判定,抽提的DNA用0.7%Agarose电泳和UV分光光度计检查抽提的基因组DNA的质量。
主要用途：

从多种组织和细胞中小规模快速抽提基因组DNA。
主要特点：
1.          适用范围广，适用于大多数组织和细胞基因组DNA的抽提。
2.          无需酚和氯仿抽提，无需乙醇沉淀，安全。
3.          DNA纯度高，得率高，无蛋白质污染，制备的DNA适用于常规分子生物学实验。。

基因组DNA抽提方法
1．样品准备：
1） 血液：
（1）   血液收集：血液必须用ACD抗凝（ACD: 0.48% Citric Acid, 1.32% Sodium Citrate, 1.47% Glucose）。 6 ml 血液用1 ml ACD抗凝。因为从用肝素抗凝的血液抽提的DNA常有PCR抑制剂存在，不能用于PCR反应。
（2）   由于红细胞和血小板不含细胞核，血液中的基因组DNA主要来自于白细胞和血液中的病毒等。通常从200µl血液可获约2－10µg DNA。如果需要较大量的DNA，可以用1000µl以上的血液，处理方法如下：每1000µl血液中加入2ml无菌水，5000×g，离心2分钟。沉淀用400µl Digestion Buffer将白细胞悬浮起来备用。
新鲜血或血清样品如果体积不超过200ul, 可以直接加入400µl Digestion Buffer¸混匀后使用。
2） 生物组织：
25－100mg组织样品用手术刀切成小块，再用液氮碾碎，或用组织匀浆器匀浆。将粉末收集到1.5ml离心管中，用400µl Digestion Buffer悬浮。
3） 石蜡生物组织：
（1）   将25－100mg石蜡生物组织样品用手术刀切成小块，转入2 ml 离心管（用户自备）中。
（2）   加入1.2 ml 二甲苯溶剂（用户自备）。用振荡器振荡。（目的是除去石蜡）
（3）   用台式高速离心机，室温，12,000转/分，离心5分钟。
（4）   小心移走上清，注意不要移走沉淀物质。
（5）   加入1.2 ml无水乙醇，小心用振荡器振荡，室温放置1分钟。
（6）   室温，12,000转/分，离心5分钟。

（7）   重复步骤5-6一次。（目的是除去残留的二甲苯溶剂）
（8）   打开离心管盖子，37 oC保温10-15分钟。（目的是除去残留的乙醇）
（9）   用400µl Digestion Buffer悬浮, 组织匀浆器匀浆。注意：石蜡切片可以直接使用，无须匀浆。
4）生物体液：
（1）   将体液转移到离心管中，根据体液的性质，确定体液的用量。
（2）   5000×g, 室温离心10分钟。
（3）   小心移走上清，沉淀00µl Digestion Buffer悬浮。如果体液的体积小于200ul, 直接加入Digestion Buffer,是总体积达到400ul,混匀。
5）尿液：
（1）   将尿液转移到离心管中，5000×g, 室温离心10分钟。
（2）   小心移走上清，沉淀用400µl Digestion Buffer悬浮。
6）眼，鼻，喉等拭样(Swabs)
（1）   将拭样(Swabs)转移到离心管中，加入2 ml PBS (或生理盐水，用户自备)，室温浸泡2-5小时。
（2）   5000×g, 室温离心10分钟。
（3）   小心移走上清，沉淀用400µl Digestion Buffer悬浮。
7）福尔马林处理的样品：
（1）   将100mg福尔马林处理样品用手术刀切成小块，转入离心管（用户自备）中。
（2）   加入2 ml PBS (或生理盐水，用户自备)，室温浸泡30分钟。
（3）   12000专/分钟， 室温离心2分钟。
（4）   小心移走上清，加入2 ml PBS (或生理盐水，用户自备)，室温浸泡30分钟。
（5）   12000专/分钟， 室温离心2分钟。
（6）   小心移走上清，沉淀用500µl Digestion Buffer悬浮, 组织匀浆器彻底匀浆。匀浆效果的好坏直接影响Proteinase K的降解效果。
（7）   取500ul匀浆（包括可能的组织块）全部转移到1.5 ml离心官中。
8) 培养细胞样品的处理：
(1)   收集细胞

a.     悬浮培养细胞
1000´g室温离心5分钟，彻底去上清，进行步骤2。

b.     单层培养细胞
蛋白酶消化细胞：倒掉培养基，用PBS洗涤细胞，然后用胰蛋白酶消化细胞。当细胞从培养瓶表面脱落以后，将细胞转移到离心管中，1000´g离心5分钟，彻底去上清，进行步骤2。
(2)   用400µl Digestion Buffer悬浮
9) 培养细菌细胞的处理
（1） 准备200µl 过夜培养细胞
（2） 12000转/分钟， 离心2分钟。彻底移走上清液，细胞用150µl TE悬浮起来。
（3） 溶菌酶处理。对于格兰氏阳性和格兰氏阴性菌酶解时间的要求是不一样的，详见下表。根据下表取适量的溶菌酶，用50µl TE溶解后全部加入到细菌样品中。格兰氏阴性菌也可以不要用溶菌处理。

注意：

1.  如果样品不能马上用于抽提基因组DNA, 可以-20 oC保存备用。
2.  样品不能反复冻融，否则基因组DNA的完整性（长度）和产率都会受到影响。
3.  样品不要太多，否则基因组DNA的纯度和产率反而下降。

2. 在按要求处理的样品中加入3ul Proteinase K，混匀，55°C保温10-60分钟。
注意：
１） 不得将Proteinase K先加入到Digestion Solution，再加到样品中。
２） 保温时间取决于样品的类型。 对于细胞样品，55°C保温5分钟足以使细胞裂解，释放出基因组DNA。而对于组织类样品，55°C保温则视降解效果而定。降解完全的样品应是透明粘稠液体。组织类样品一般在1-3小时内作用完全。过夜处理通常不影响产率。
3. 高速室温12000转/分离心5分钟，将上清转移到1.5ml无菌离心管中，加入300ul Solution B, 混匀。

子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)。转移时用1ml Tip头取样品。
5. 用台式离心机，12,000转/分，室温离心1分钟。
6. 取下3S柱，弃去离心管中的废液。将柱子放回同一根离心管中，加入500µl Wash Solution, 12,000转/分，室温离心1分钟。
7. 重复步骤6一次。
8. 取下3S柱，弃去离心管中的全部废液。将柱子放回同一根离心管中，10,000转/分，室温离心２分钟，以除去残留的Wash Solution。
9. 在柱子中央加入100µl TE, 将柱子放入新的干净1.5 ml或２.0ml离心管中，室温或37-55°C放置２分钟。12,000转/分，室温离心1分钟。收集管中的液体即为基因组DNA。根据用途，样品可以4°C或-20°C保存。
注意：
1）为提高洗脱效率，可以将TE预热到37-55°C。
2）如果样品中基因组DNA含量很低，用30µl TE洗脱可以提高洗脱液的样品浓度，但产率有所下降。重复步骤8-9，可以提高产率20%。
10. 用分光光度计测量DNA含量按1OD260=50µg基因组DNA，或者走0.7% Agarose 胶判定DNA的完整性，也可以判定样品中是否有RNA。
注意：
1)血液样品中的DNA产量取决于血细胞的数量。
2)从Agarose Gel仅能观察到白细胞基因组DNA， 血清中病毒DNA因含量太少，不能用Agarose Gel直接观察。
3) 通常50µl PCR反应中用2－5µl DNA。