基因组削减杂交试剂盒 K20020/20021
CAT# |
SIZE |
PRICE（￥） |
K20020 |
7 |
3000 |
K20021 |
15 |
5500 |
试剂盒组成：
组成 |
组成 |
Rsa Buffer 10x ( Buffer B) 0.5ml |
Adaptor1 10uM 20ul |
Rsa 10U/ul 12ul |
Adaptor2R 10uM 20ul |
EDTA 0.2M 1ml |
Hybridization Buffer (4X) 50ul |
NH4AC 4M 250ul |
4XdNTP (10mM each) 50ul |
T4 DNA ligase 10ul |
Taq DNA Polymerase (5U/ul) 200U |
T4 DNA Ligase buffer (10X) 0.5ml |
Taq DNA Polymerase buffer w/Mg 500ul |
Dilution Buffer 1.5ml |
PCR Primer 1 50uM 30ul |
Nested Primer 1 50uM 30ul |
Nested Primer 2R 50uM 30ul |
所有试剂-20度保存
简介：该试剂盒是让研究者比较两组相关样品中，特定基因的表达情况，差减杂交手段是获得在一组样品中表达而在另一组样品中不表达的特异基因的强有力工具。差减杂交的基本原理都是一样的，但是在具体操作步骤上还是有一定的差距的。我们提供的试剂盒通过从两组样品中平行抽提DNA,那些包含了特异片段的本为受试者（tester）, 而称那些用于对照的DNA为参照者（driver）。受试者DNA与参照者DNA进行杂交，然后将杂交的序列除去。这样，未杂交的DNA就代表了在受试者中表达或存在，而在参照者中不存在的基因。有差异的这些扩增片段克隆到T载体中，构建成差异性文库。通过对插入片段的测序和杂交分析，筛选出差异片段（基因）。（见图1）
本试剂盒包含步骤二至七中主要的分子生物学试剂。
说明：该实验过程步骤较多，如果有一步不成功，都会是实验无法继续下去。建议按要求检查每个主要实验的现象是否正确，如果有疑问请排除原因或向申能博彩技术人员联系。
该步骤提供的主要试剂（本试剂盒提供的试剂满足7次削减杂交实验）
用户需要自备的试剂：
酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），氯仿：异戊醇（24：1），无水乙醇等
操作过程：
一、准备高纯度基因组
客户需要制备出大分子量的基因组DNA, 说明采用传统的方式制备的基因组DNA都可以，但是要求条件一致，没有RNA污染。DNA需要2-5ug。
二、酶切消化
1．在冰里放置的离心管中加入以下成分（Tester和Driver 基因组DNA同时分别处理）：
Genomic DNA （Tester或Driver） 2微克
10x Buffer B 5微升
Rsa I (10 units/微升) 1.5微升
加水到50微升
2．混匀离心。
3．37度保温5-16小时。
4．取出5微升酶切反应液鉴定酶切效果。
5．加入2.5微升20倍EDTA/Glycogen 终止反应。
6．加入50微升酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）混匀高速离心。
7．取出上清转移至干净的试管中，加入50微升的氯仿：异戊醇（24：1），混匀高速离心(14000rpm,10分钟)。
8．取出上清，转移至干净的离心管中，加入25微升的4M 醋酸铵和187.5微升的95%的乙醇。
9．混匀，高速离心14000rpm,20分钟 。
10．弃除上清加入200微升80%的乙醇，高速离心14000rpm, 5分钟。
11 弃除上清，倒置空气干燥10分钟，加入6.5微升的灭菌水，-20度保存。
三、接头连接（见图2）
1 取1.2ul酶切消化的DNA溶液，加入1.8ul的灭菌水稀释。
2 按顺序依次加入以下成分：
H2O 5微升
10X Ligation Buffer 1微升
T4 DNA Ligase (400unit/微升) 1微升
Diluted tester DNA 1微升
Adaptor 1 or 2R (10uM) 2微升
3 将2微升的Tester -1 和2微升的Tester -2R 混合，以便杂交对照。
4 将2，3两步连接液16度过夜。
5 加入1微升0.2M EDTA 终止反应。
6 72度保温灭活 5分钟，离心。
四、 第一次杂交
1 按顺序依次加入以下成分：
杂交1
Rsa I-digested driver 2ul
Adaptor 1-ligated Tester -1 1ul
4X Hybridization Buffer 1ul
杂交2
Rsa I-digested driver 2ul
Adaptor2R-ligated Tester-2R 1ml
4X Hybridization Buffer 1ul
2 加入一滴石蜡油，离心。
3 98度保温1.5min。
4 63度保温1.5小时。
五、 第二次杂交：
1 按顺序依次加入以下成分：
Driver DNA（Rsa I Digested） 1 ml
2X Hybridization Buffer 1 ml
（注意2X杂交液用4X稀释）
2 小心混合，加入一滴石蜡油。
3 98度保温1.5分钟。
4 用移液器(设定在15-20ul)吸取含有接头Adaptor 1的Tester第一次全部杂交混合液，留点气柱。
5 再吸取本步骤2的变性混合液，留出气柱。
6 将TIP头离的溶液一次性加入含有接头2R的Tester第一次杂交混合液中混匀。
7 离心，将混合液收集到管底。
8 63度过夜
9 加入200ul稀释缓冲液（Dilution Buffer）混匀
10 63度保温7分钟。-20度保存。
六、 PCR扩增
第一轮PCR
ddH2O 40.5ml
Buffer 5ml
dNTP 1ml
PCR Primer1 1ml
Template（步骤五.9） 1ml
TAQ酶 1ml （2.5U）
反应条件： 75℃ 5min
94℃ 2min
1 94℃ 30sec
2 66℃ 30sec
3 72℃ 1.5min GOTO 1 30cycles
72℃ 5min
第二轮PCR
取上述反应产物1ml做二次PCR；
ddH2O 40.5ml
Buffer 5ml
dNTP 1ml
Nested PCR Primer1 1ml
Nested PCR Primer2R 1ml
Template(第一轮PCR产物) 1ml
TAQ酶 1ul （2.5U）
反应条件：
94℃ 2min
1 94℃ 30sec
2 60℃ 45sec
3 72℃ 1.5min GOTO 1 30cycles
72℃ 5min
七．电泳检测
将上述第二次PCR反应的产物用1.5%电泳分离，扩增片段集中在200-500bp之间。如果在上述某个步骤实验失败，将不能得到PCR扩增产物。PCR扩增时需要增加适当的对照，以检查扩增体系是否有污染。
八、PCR扩增片段（差异片段）的克隆 （客户自备）
该步骤参考T克隆说明书
一．PCR产物扩增的回收
二．PCR产物的T载体克隆和鉴定
三．PCR产物序列分析
位来访者