BAC/PAC高纯质粒制备试剂盒 K1500/1501

BAC/PACHigh Pure DNA Isolation Kit V3

试剂盒组成：

注：温度低时，Solution II有沉淀析出，保温溶解后使用。

用户需要准备的仪器：
  高速离心机带有10ml和50ml转子及离心管，水平转子为佳（便于将DNA收集到管底）！！ 15ml, 50ml离心管，无水乙醇，去离子水等

实验操作步骤
1.接内含BAC或PAC质粒的单克隆与30ml的LB培养基中，加入合适的抗菌素。如需要放大制备，请准备若干30ml的培养。每30ml一般能得到2-3ugDNA,所以根据需要准备细胞的接种数量。37度过夜培养。
2.用50ml离心管，离心收集细胞，离心速度2000-5000转/分，10分钟。收集好的细胞可以-20度保存，不会损伤质粒。
3.加入4度预冷的1 ml Solution I，小心用1ml或更大的移液头（最好使用电动移液器）将细胞悬浮起来。加入30ul 50mg/ml Lysozyme, 盖上盖子，上下颠倒小心混匀。室温放置5分钟。
4.加入2 ml Solution II，盖上离心管盖，小心上下颠倒几次，冰里保温5分钟，溶液呈透明状。
5.加入1.5 ml Solution III，盖上离心管盖，小心上下颠倒几次，冰里保温5分钟。
6.10,000xg, 4度离心10分钟。
7.将上清小心（不要将沉淀带入）到入或用10ml一次性塑料吸管吸到15ml离心管中，加入30ul RNase (DNase free),小心混匀，37度保温60分钟。
8.加入等体积的Phenol/chloroform(1:1),盖上盖子，上下小心颠倒10次，5000xg离心20分钟（室温）。
9.将上清用10ml一次性塑料吸管吸到合适的离心管中，加入等体积的异丙醇，盖上离心管盖，小心上下颠倒几次，10,000xg, 4度，离心20分钟。离心取出离心管，在离心管的外侧做上记号，便于辨认沉淀的位置。
10.小心移走上清，加入2ml 70%的冷乙醇，转动离心管，使离心管管底都被洗过。10,000xg, 4度，离心20分钟。离心取出离心管，在离心管的外侧做上记号，便于辨认沉淀的位置。
11.小心移去上清，真空干燥5-10分钟。去除真空时，避免丢失沉淀，请正确使用抽真空装置。
12.加入100ul无菌水，室温放置30分钟，中途用手指弹管底，使DNA溶解，小心将DNA转移到1.5ml离心管中。