快速感受肽细菌制备试剂盒 K1040
Quick Competent Cell Making Kit
CAT# |
SIZE |
PRICE（￥） |
K1040 |
20ml |
300 |
试剂盒组成 |
数量 |
储存温度 |
Soluion SS（无菌） |
10 ml X 2 |
4C |
说明：
感受态制备无需冷冻离心机。感受态细胞制备省时，效率达到107 以上，基本满足一般细菌转化要求。提供的溶液可以制备20ml感受态细胞，每次转化用200ul。
用户需要自惫的物品：
低温冰箱，制冰机（最佳配置），1 ml 移液Tips 等， 分光光度计（可见光）， LB/20mM Glucose培养基， LB培养板，SOC培养基（转化用）等。
实验前准备工作：
1．将1 ml 移液Tips，1.5 ml 离心管（本试剂盒提供），高温高压灭菌后烘干。制备感受态细胞前， 将1.5ml无菌离心管置于-20C预冷。
2．将Solution SS置于冰里备用。
3．准备冰（用制冰机制备）。如果用冰箱制备需要将冰块敲碎，能使离心管立于其中。
感受态细胞制备实验步骤：
1．将DH5a或其它待转化的属主细胞接种于2ml LB/20mM Glucose培养基中，过夜培养，37C, 摇床转速：250转/分。2．次日，取0.1ml过夜培养细胞，接种于10ml LB/20mM Glucose培养基（用100ml三角烧瓶培养），250转/分，37度培养到OD595为0.3-0.4之间。（测定细胞密度时需要用空白LB作参照）。注意：细胞密度不能超过0.45，否则需要重新准备细胞。在培养细胞的同时需要完成实验前的准备工作。
3．取出摇瓶，将摇瓶置于冰里，冰上放置5分钟后，加入10ml冰冷的Solution SS。在冰上小心用1ml Tip将细胞悬浮起来。注意：1ml的取液器设定在500ul,悬浮细胞要轻，防止细胞进入取液器内。
4．将上述细胞用1ml Tip分装，每管0.2ml.。细胞可以立即使用或储存。
5．将感受态细胞迅速转移到-20度或更低的低温冰上中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。
转化：
1. 新鲜制备的或-70℃下保存的200ml感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻地将细胞均匀悬浮。
2. 加入5ml连接液，轻轻混匀。
3. 冰上放置30分钟。
4. 42℃水浴热激60秒。
5. 冰上放置2分钟。
6. 加800ml SOC培养基，37℃ 250rpm振荡培养1小时。
7. 室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉800 ml上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。
8. 将细菌涂布在90mm平板中，平板在使用前预先用20ml 100mM IPTG和40ml 20mg/ml X-gal 涂布（无需蓝白斑筛选的转化，IPTG和X-gal可以省略）。
注：细菌的用量依连接的效率及感受态细胞的感受率而进行适当的调整。
