ECL蛋白质印迹转移全套系统2.0 K06
3S ECL Western Blotting Reagent Set (Ab Minus)
CAT# |
SIZE |
PRICE（￥） |
K06 |
1套1000cm2 |
650 |
特别提醒： 本系统仅仅适用于硝酸纤维膜(Nitrocelluolose)和PVDF膜!针对目的蛋白质的第一抗体或第二抗体必须是辣根过氧化物酶(HRP)标记的！仔细阅读方法后在做实验！！
试剂盒组成：
Components and Size |
K06 (1000 cm2) |
Luminol / Enhancer Solution( a) |
50 ml |
注：
(a) Luminol/Enhancer Solution和CL Peroxide Solution需要4C保存，稳定期一年。
(b) Blocking Solution 要注意防霉和长菌。
(c) 本试剂盒提供的溶液和抗体可以用于500cm2膜，每1cm2用0.1ml发光溶液。
用途：Western Blotting 实验中，用化学发光方法检测转移在PVDF膜或硝酸纤维膜上的蛋白质。该法比化学显色方法灵敏（ng水平），省时，比同位素法安全，易操作。
TTBS: 0.1% Tween 20, 100 mM Tris-HCl, pH7.5, 0.9% NaCl (灭菌后室温保存)。
基本原理：为了检测样品中有无特定的蛋白质或特定蛋白质的表达和分布情况，Western Blotting方法是最基本的方法。样品经过SDS-PAGE电泳分离后，电转移到PVDF膜或硝酸纤维膜。经过封闭，特定一抗与膜上特定的蛋白质特异性结合，HRP标记的广谱二抗和一抗结合。HRP水解底物溶液中的鲁米若（Luminol）产生很强的光信号，使和它接触的X-光片感光,进而确定蛋白质的表达情况和分布。
操作步骤：
1. 参考有关方法用SDS-PAGE电泳分离蛋白质。
2. 参考有关方法将PAGE胶中的蛋白质转移到PVDF膜或硝酸纤维膜上。注意： PVDF膜在转移前需要用100%甲醇处理1-2秒，然后用电转缓冲浸泡10分钟左右后使用。为避免混淆样品上下和前后次序，通常在膜的左上角剪去一小块，对应与第一个样品的最上端。
3. 小心用镊子取出膜（不得用手接触膜）。放入合适的杂交塑料袋或干净的Tip头盒子中。按每平方厘米0.1ml加入Blocking Solution, 使Blocking Solution充分覆盖膜，封袋或盖上盖子，室温保温30-60分钟。将杂交袋或盒子放在旋转振荡器上，不停震荡。如没有振荡器，必须间或混匀，尽可能除去膜表面的气泡。如果用杂交袋，10x10cm膜 5ml Blocking Solution 就可以了。
4. 倒出杂交袋中的Blocking Solution,加入稀释好的一抗（根据抗体的滴度和需要的体积用Blocking Solution稀释一抗。如果用杂交袋，10x10cm膜5ml Blocking Solution 就可以了。如果使用Tip盒子，需要提高抗体的体积，使溶液充分覆盖膜表面。封袋或盖上盖子，室温保温60分钟。将杂交袋或盒子放在旋转振荡器上，不停震荡。如没有振荡器，必须间或混匀，尽可能除去膜表面的气泡。
5. 倒出一抗（4C保存（<2天），可以重复用一到两次），将膜用镊子转移到干净的Tip塑料盒子中，用50ml TTBS洗4次，每次10分钟。如果一抗已经标有HRP, 执行步骤8。 6. 将膜转移到一个新的杂交袋中，加入用稀释的用Blocking Soluton稀释二抗(Anti-Rabbit IgG HRP conjugated或Anti-Mouse IgG HRP conjugated)（10x10cm膜 5ml
Blocking Solution 就可以了。）如抗体稀释度为1:50，使用时取100ul抗体，加入5ml Blocking Solution，混匀使用即可。室温振荡保温60分钟。如没有振荡器，必须间或混匀，尽可能除去膜表面的气泡。
7. 倒出二抗（4C保存（<2天），可以重复用一到两次），将膜用镊子转移到干净的Tip塑料盒子中，用50ml TTBS洗4次，每次10分钟。
8. 倒出TTBS, 用1X Substrate Equilibration Buffer室温洗两次，每次15分钟。1X Substrate Equilibration Buffer的配置：45ml水+5 ml Substrate Equilibration Buffer, 混匀。
9. 按每平方厘米膜面积用0.1ml配置发光液：根据发光液的需要量，取等体积Luminol/Enhancer Solution和CL Peroxide Solution，混匀备用。该底物必须在6小时内使用。
10. 从TTBS液中取出膜，平放在干净的保鲜膜上，膜的正面（蛋白质面）朝上，在膜的中央加适量的发光液（10X10cm的膜加2ml发光液），溶液向四周迅速扩散，覆盖所有膜面。如果溶液不能完全覆盖膜面，添加。室温保温5分钟左右。注意：如果信号强，在暗房中能直接看到阳性条带。
11. 用镊子夹起膜，除去多余的溶液，平放在干净的保鲜膜上，膜的正面（蛋白质面）朝上，在转移膜的上面再覆盖一层保鲜膜，除去保鲜膜与转移膜之间的空气泡，沿着膜四周反向折起保鲜膜。
12. 在暗房中，将膜的正面对着X-光片，放入暗盒。第一次曝光时间定1分钟，立即按要求对X-光片进行显影和定影，确定最佳曝光时间。曝光时间从数秒到数小时不等。特别弱的过夜曝光也可。
13. 确定检测蛋白质的大小和位置：通常需要将显影后的X-光片和转移膜对照确定。膜本身的四周边界可以从X-光片上分辨出来。
常见的几个事项：
1．使用过后的转移膜有时仅需要加入发光液，可以再次显色，但本底有所提高。
2．PVDF比硝酸纤维膜给出较强的信号。选高质量的PVDF膜。尽可能不用Nylon膜。
3．与抗体结合以后，要保证膜处于湿润状态，否则本底较高。
