化学显色蛋白质印迹转移系统试剂组合 K05AP/05HP

Visual AP Western Blotting Reagent Pack

特别提醒：

试剂盒组成：

注：
(a)  NBT和BCIP-20C保存，稳定期一年以上。不推荐将两者混合或与底物平衡液混合存放。
(b)  Blocking Solution VW内含防腐剂，但仍要注意防霉和长菌。
(c)  本试剂盒提供的溶液可以用于1000cm2膜Western 蛋白质检测。
用途：Western Blotting 实验检测目的蛋白质。要求：针对目的蛋白质的第一抗体或第二抗体必须是碱性磷酸酶（AP）标记的！广谱第二抗体上标有的AP水解BCIP,形成的产物在NBT的氧化下形成蓝灰色沉淀，从而判定目的蛋白质的位置和相对的表达量。与化学发光方法相比，该法操作简单，不需要显影和暴光设备。
用户需要自备的试剂和材料：一抗, 二抗（AP标记），PVDF膜或硝酸纤维膜，Western Blot(蛋白质转移试剂和设备，预染蛋白质分子量标准（非必须），TTBS等
    TTBS: 0.1% Tween 20, 100 mM Tris-HCl, pH7.5, 0.9% NaCl (灭菌后室温保存)。

操作步骤：
1. 参考有关方法用SDS-PAGE电泳分离蛋白质。
2. 参考有关方法将PAGE胶中的蛋白质转移到PVDF膜或硝酸纤维膜上。注意： PVDF膜在转移前需要用100%甲醇处理1-2秒，然后用电转缓冲浸泡10分钟左右后使用。为避免混淆样品上下和前后次序，通常在膜的左上角剪去一小块，对应与第一个样品的最上端。
3. 小心用镊子取出膜（不得用手接触膜）。放入合适的杂交塑料袋或干净的Tip头盒子中。按每平方厘米0.1ml加入Blocking Solution, 使Blocking Solution充分覆盖膜，封袋或盖上盖子，室温保温30-60分钟。将杂交袋或盒子放在旋转振荡器上，不停震荡。如没有振荡器，必须间或混匀，尽可能除去膜表面的气泡。如果用杂交袋，10x10cm膜 5ml Blocking Solution 就可以了。
4. 倒出杂交袋中的Blocking Solution,加入稀释好的一抗（根据抗体的滴度和需要的体积用Blocking Solution稀释一抗。如果用杂交袋，10x10cm膜5ml Blocking Solution 就可以了。如果使用Tip盒子，需要提高抗体的体积，使溶液充分覆盖膜表面。封袋或盖上盖子，室温保温60分钟。将杂交袋或盒子放在旋转振荡器上，不停震荡。如没有振荡器，必须间或混匀，尽可能除去膜表面的气泡。
5. 倒出一抗（4C保存（<2天），可以重复用一到两次），将膜用镊子转移到干净的Tip塑料盒子中，用50ml TTBS洗4次，每次10分钟。如果一抗已经标有AP,执行步骤8。
6. 将膜转移到一个新的杂交袋中，加入用稀释的用Blocking Solution稀释二抗(Anti-Rabbit IgG AP conjugated或Anti-Mouse IgG AP conjugated)（10x10cm膜 5ml Blocking Solution 就可以了。）如果抗体稀释度为1:500，使用时取10ul抗体，加入5ml Blocking Solution，混匀使用。室温振荡保温60分钟。如没有振荡器，必须间或混匀，尽可能除去膜表面的气泡。
7. 倒出二抗（4C保存（<2天），可以重复用一到两次），将膜用镊子转移到干净的Tip塑料盒子中，用50ml TTBS洗4次，每次10分钟。
8. 倒出TTBS, 用AP Substrate Solution室温洗一次5分钟。
9. 配置AP底物溶液：6 ml AP Substrate Solution + 40 ul NBT Solution + 40 ul BCIP Solution,混匀。该底物必须在2小时内使用。