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化学显色蛋白质印迹转移系统 K03M/04R

Visual AP Western Blotting System

CAT#	SIZE	PRICE（￥）
K03M	1套1000cm2	850
K04R	1套1000cm2	850

特别提醒：

本系统仅仅适用于硝酸纤维膜(Nitrocelluolose)和PVDF膜
使用前请仔细阅读操作方法！！
针对目的蛋白质的第一抗体必须是兔 (Rabbit)或鼠产生的。

试剂盒组成：

Components and Size	K03M (1000cm2)	K04R (1000 cm2)	保存温度
Anti-Rabbit IgG AP conjugated ( a) Anti-Mouse IgG AP conjugated( a) NBT Solution( b) (50mg/ml) BCIP Solution( b) (25mg/ml) Blocking Solution VW (c) AP Substrate Buffer 说明书	------ 0.05ml 0.5 ml 0.5 ml 200 ml 100 ml １份	0.05ml ----- 0.5 ml 0.5 ml 200 ml 100 ml １份	－20C －20C －20C －20C 4C 室温

Anti-Rabbit IgG AP conjugated ( a)
Anti-Mouse IgG AP conjugated( a)
NBT Solution( b) (50mg/ml)
BCIP Solution( b) (25mg/ml)
Blocking Solution VW (c)
AP Substrate Buffer
说明书

------
0.05ml
0.5 ml
0.5 ml
200 ml
100 ml
１份

0.05ml
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0.5 ml
0.5 ml
200 ml
100 ml
１份

－20C
－20C
－20C
－20C
4C
室温

注：
(a)抗体应变免反复冻融。蛋白质免疫印迹抗体的稀释度参见抗体管标签，一般为1:500-2000稀释。
(b)NBT和BCIP-20C保存，稳定期一年以上。不推荐将两者混合或与AP Substrate Buffer混合存放。
(c)Blocking Solution VW内含防腐剂，但仍要注意防霉和长菌。
(d)本试剂盒提供的溶液和抗体可以用于1000cm2膜Western 蛋白质检测。
用途：
   Western Blotting 实验检测目的蛋白质。要求：针对目的蛋白质的第一抗体必须是兔（Rabbit）或鼠产生的。广谱第二抗体上标有的碱性磷酸酶（AP）水解BCIP,形成的产物在NBT的氧化下形成蓝灰色沉淀，从而判定目的蛋白质的位置和相对的表达量。与化学发光方法相比，该法操作简单，不需要显影和暴光设备。
用户需要自备的试剂和材料：
   一抗（兔或鼠产生的抗体），PVDF膜或硝酸纤维膜，Western Blot(蛋白质转移试剂和设备，预染蛋白质分子量标准（非必须），TTBS等
    TTBS: 0.1% Tween 20, 100 mM Tris-HCl, pH7.5, 0.9% NaCl (灭菌后室温保存)。
操作步骤：
1. 参考有关方法用SDS-PAGE电泳分离蛋白质。
2. 参考有关方法将PAGE胶中的蛋白质转移到PVDF膜或硝酸纤维膜上。注意： PVDF膜在转移前需要用100%甲醇处理1-2秒，然后用电转缓冲浸泡10分钟左右后使用。为避免混淆样品上下和前后次序，通常在膜的左上角剪去一小块，对应与第一个样品的最上端。

3. 小心用镊子取出膜（不得用手接触膜）。放入合适的杂交塑料袋或干净的Tip头盒子中。按每平方厘米0.1ml加入Blocking Solution, 使Blocking Solution充分覆盖膜，封袋或盖上盖子，室温保温30-60分钟。将杂交袋或盒子放在旋转振荡器上，不停震荡。如没有振荡器，必须间或混匀，尽可能除去膜表面的气泡。如果用杂交袋，10x10cm膜 5ml Blocking Solution 就可以了。
4. 倒出杂交袋中的Blocking Solution,加入稀释好的一抗（根据抗体的滴度和需要的体积用Blocking Solution稀释一抗。如果用杂交袋，10x10cm膜5ml Blocking Solution 就可以了。如果使用Tip盒子，需要提高抗体的体积，使溶液充分覆盖膜表面。封袋或盖上盖子，室温保温60分钟。将杂交袋或盒子放在旋转振荡器上，不停震荡。如没有振荡器，必须间或混匀，尽可能除去膜表面的气泡。
5. 倒出一抗（4C保存（<2天），可以重复用一到两次），将膜用镊子转移到干净的Tip塑料盒子中，用50ml TTBS洗4次，每次10分钟。
6. 将膜转移到一个新的杂交袋中，加入用稀释的用Blocking Soluton稀释二抗(Anti-Rabbit IgG AP conjugated或Anti-Mouse IgG AP conjugated)（10x10cm膜 5ml Blocking Solution 就可以了。）本系统提供的抗体稀释度为1:500，使用时取10ul抗体，加入5ml Blocking Solution，混匀后使用。室温振荡保温60分钟。如没有振荡器，必须间或混匀，尽可能除去膜表面的气泡。
7. 倒出二抗（4C保存（<2天），可以重复用一到两次），用镊子将膜转移到干净的Tip塑料盒子中，用50ml TTBS洗4次，每次10分钟。
8. 配置AP显色底物溶液：5 ml AP Substrate Buffer + 50ml NBT Solution + 50 ml BCIP Solution, 混匀。该底物必须在2小时内使用。
9. 将步骤7中的TTBS弃去，将膜转移到杂交袋中，加入步骤8中配置的AP底物溶液。让溶液覆盖所有膜面，除去膜表面所有的气泡。室温（或37度）保温10-30分钟左右。注意观察条带的出现，适时终止反应。
10. 终止：取出膜，将膜用蒸馏水冲洗。
11. 膜的保存：室温凉干后，放入干净的自封袋中短暂保存。永久保存需拍照或扫描存入计算机。
常见的几个事项：
1．PVDF比硝酸纤维膜给出较强的信号。选高质量的PVDF膜。尽可能不用Nylon膜。
2．与抗体结合以后，要保证膜处于湿润状态，否则本底较高。
3．没有信号的原因：有些抗体不识别变性抗原，有时需要考虑电泳过程对蛋白质结构的影响；样品中无待测蛋白质或含量过低；一抗滴度不合适；

4．本底过高原因：转移膜封闭不充分；与抗体保育后洗得不彻底；膜在处理过程中过干等。

Components and Size